兩種抑郁模型的行為學比較

摘要

目的: 比較5-經(jīng)色胺神經(jīng)元損毀致小鼠抑郁癥狀模型與慢性刺激抑郁模型小鼠強制游泳實驗和懸尾實驗中的行為學特點， 評估兩種模型在研究抑郁癥中的適用性。

方法:實驗于2005-04/07 在解放軍第四軍醫(yī)大學完成。 ①分組:40 只C57BU 6 小鼠隨機分為慢性刺激組 、5-經(jīng)色胺損毀組、假手術(shù)組及空白對照組。②模型制備:慢性刺激組小鼠每日慢***刺激，共21d;5-9色胺損毀組小鼠腦室中注射特異性5-9 色胺毒劑5,7一 雙經(jīng)色胺，特異性損毀小鼠中縫背核中的5-f} 色胺能神經(jīng)元; 假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室給予注射等量的生理鹽水。③觀察指標:分別測試兩種模型小鼠的體質(zhì)量變化、蔗糖攝取實驗、強制游泳實驗和懸尾實驗等行為學表現(xiàn)。

結(jié)果:40 只小鼠均進人結(jié)果分析。 5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組的小鼠表現(xiàn)出多項抑郁癥狀:①兩者模型小鼠體質(zhì)量增加緩慢、增加量明顯減少。②兩種模型小鼠均表現(xiàn)糖攝取量明顯減少。③兩種模型小鼠強制游泳實驗和懸尾實驗中無動時間的總和均明顯延長。

結(jié)論: 慢性刺激模型和5-經(jīng)色胺損毀模型均復制出人類了抑郁癥的多項表現(xiàn)， 提示環(huán)境因素的改變和5-經(jīng)色胺降低在抑郁癥的發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。

主題詞:抑郁癥;5-經(jīng)色胺:慢性刺激

0 引言

抑郁癥是一類發(fā)病率很高的**， 世界衛(wèi)生組織宣布世界上大約有 17% 的人口在一生中會遭遇抑郁癥，給社會造成很大的財力、物力、人力的浪費。關(guān)于抑郁癥的研究取得很多進展， 但是其確定的病理機制尚不清楚。其中一個原因是抑郁癥的表現(xiàn)非常多樣，因此比較難以在實驗室模仿抑郁癥的全部癥狀。另外，抑郁癥的很多癥狀以患者的自身感覺和自述為主， 而在動物模型上很難模擬; 尤其是患者反復的罪惡感和**傾向，在動物身上不能模擬出來。但是動物模型還是可以重現(xiàn)抑郁患者的很多基本生理學和行為學的反應。本實驗比較兩種動物模型的抑郁樣行為學實驗， 以評價它們在抑郁癥基礎(chǔ)研究中的應用。

1 材料和方法

設(shè)計:隨機對照動物實驗。

單位:解放軍第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院康復與理療科。

材料:實驗于 2005-04/07 在解放軍第四軍醫(yī)大學完成。 40 只C57BL/6 小鼠， 鼠齡 10 周， 體質(zhì)量20 21g，無特殊病原體，第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心提供。 置于安靜、溫暖、晝夜明暗周期為8:00-20:00光照、20:00一 次日8:00 黑暗的實驗室中， 自由飲水、攝食。 飼養(yǎng) 1周后，隨機分為慢性刺激組、5-輕色胺損毀組、假手術(shù)組及空白對照組，每組 10 只。設(shè)計、實施、評估者:實驗設(shè)計為**作者，在日本大阪大學經(jīng)過行為學評估培訓;實施及評估為全部作者，動物分組及編號由**、三、四作者進行，評估采用盲法。

方法: 動物模型制備:① 慢性刺激模型:每日給予小鼠刺激[ 9，小鼠單獨飼養(yǎng)，每天隨機暴露于以下刺激中的一種，共持續(xù) 21 d:干鋸屑墊料、置于空籠、籠子傾斜(45 ℃)、播放掠食者錄音、晝夜顛倒、冷水游泳。 在蔗糖攝取實驗前**不給予任何刺激。 2 5-9 色胺損毀模型:5-經(jīng)色胺損毀組和假手術(shù)組手術(shù)前腹腔注射去甲丙咪嗓( 25 mg/kg) 和諾米芬辛( 10 mg/kg),40 min 后給予****鈉( 65 mg/kg)腹腔麻醉后，將動物固定在立體定位儀。 按照以下位置(與前自距離) :向后一0.7 mm ，旁開 1.0 mm ，深度一 1.7 mm ，用 10 [ LL 漢密頓微量注射器進行雙側(cè)腦室注射。 5-輕色胺損毀組經(jīng)腦室注射5,7一 雙經(jīng)色胺(Sigma, USA )50 jig,溶解于含1g/L檸檬酸的生理鹽水)o假手術(shù)組注射等量的含1g/L檸檬酸的生理鹽水。 注射后留針5 min, ③空白對照組:不接受注射或刺激，群體飼養(yǎng)。 各組每天經(jīng)同一人輕柔抓取動物5 m in,體質(zhì)量測定:每兩 日稱量一次小鼠體質(zhì)量，直至21 d，將體質(zhì)量增長繪制曲線，另外計算各組第 21 天與實驗前比較體質(zhì)量增加的數(shù)值，進行統(tǒng)計分析。

蔗糖攝取實驗:在造模前和造模后 21 d，分別計算小鼠在1h內(nèi)飲用10g/L蔗糖溶液量， 以此乒映小鼠的獎賞反應程度。 在實驗前 14 h 內(nèi)， 停止攝取食物和水。

懸尾實驗:由上海欣軟信息科技有限公司提供，記錄6 min 內(nèi)的第 2-6 分鐘的不動時間總和，此成績反應動物的無助程度。

強制游泳實驗:由上海欣軟信息科技有限公司提供， 記錄6 m in 內(nèi)的第 2-6 分鐘的不動時間總和， 此成績反應動物的無助程度。

**組織化學染色: 動物存活 21 d 后，由過量****鈉( 70 mg/kg)麻醉后，用 15 m L 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液和50 mL 40 g/L 多聚甲醛灌注固定后，立即取腦置于200 g/L 蔗糖溶液，4 ℃過夜沉底后，取全腦進行冰凍切片( Cry ostal;Leitz,W etzal,Germany)，片厚30 Rm ,隔五取一收集于0.01mol /L 磷酸鹽緩沖液中。切片經(jīng)封閉液(磷酸鹽緩沖液， 含10 g/L Bovineserum, 50 酬L NGS, 3 歲L Triton X -100) 30 min，后分別浸人一抗 : 兔抗酪氨酸經(jīng)化酶抗體沙500,CHEM ICON Intern ational Inc); 兔抗5-輕色胺抗體(1:5 000, Sigma);4 ℃孵育24 h,PBST 洗滌3 次后人鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白( 1:1000'Sigm司4 9C孵育24 h,經(jīng) PBST 洗滌 3 次后浸人混合熒光二抗 Alexa 546goatantirabbitIgG ( 1:1 000, M olecularprobes)和Alexa

538 goatantimouse IgG ( 1:1 000, M olecularprobes)中，室溫避光孵育 3 h ，隨后 PBST 洗滌后封固，在激光共聚焦熒光顯微鏡(CarlZeiss M icrolmaging, Inc.)下觀察并采圖。

主要觀察指標:① 小鼠造模前和造模后不同時間的體質(zhì)量改變及蔗糖攝取、 強制游泳實驗和懸尾實驗等抑郁相關(guān)行為學測定。②小鼠中縫背核5-9 色胺神經(jīng)元的改變。

統(tǒng)計學分析:各組數(shù)據(jù)以x1: 表示，由**作者利用 SPSS 11.0 軟件進行單因素方差分析，組間差異采用 Dunnett's 后檢驗，a=0.05 作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物數(shù)量分析

實驗中參加實驗小鼠40 只，無中途脫落，進人結(jié)果分析小鼠40 只。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量變化 見圖1。在動物造模前，各組動物的體質(zhì)量沒有顯著差別，隨著時間延長，各組小鼠的體質(zhì)量均表現(xiàn)出逐漸增加。其中，假手術(shù)組和空白對照組小鼠的體質(zhì)量增加明顯，約增加了4 g，而5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組的小鼠體質(zhì)量增加緩慢，增加量也明顯比假手術(shù)組和空白對照組小鼠少。

2.3 各組小鼠蔗糖攝取實驗結(jié)果 見圖 2，在空白對照組和假手術(shù)組小鼠的 1 h 內(nèi)的蔗糖溶液攝取量幾乎完全一樣，而5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組小鼠的蔗糖溶液攝取量明顯減少( P < 0.01)，尤其是5-經(jīng)色胺

損毀組。

2.4 各組小鼠強制游泳實驗和懸尾 實驗結(jié)果 見圖3，在懸尾實驗和強制游泳實驗中，空白對照組和假手術(shù)組小鼠的“ 無動時間”無差別，5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組小 鼠在兩個實驗中的無動時間均明顯延長伊 < 0.01)， 其中5-經(jīng)色胺損毀組在強制游泳實驗中無動時間的延長更顯著， 而慢性刺激組在懸尾實驗中的無動時間的延長更顯著。

2.5 5-夯色胺**組化染色 在空白對照組和假手術(shù)組小鼠的中縫背核中5-經(jīng)色胺能神經(jīng)元呈 5-經(jīng)色胺**組化染色陽性， 陽性物質(zhì)主要出現(xiàn)在胞漿中，形態(tài)規(guī)則 ，分布均勻，而 5,7一 雙輕色胺側(cè)腦室注射后21 d 小鼠的中縫背核中，5-輕色胺陽性神經(jīng)元幾乎完全消失，只有少量纖細的纖維。

3 討論

抑郁癥的動物模型根據(jù)誘發(fā)抑郁的方式不同，可以分為**誘發(fā)和環(huán)境因素改變誘發(fā)兩大類模型。 慢性應激抑郁模型具有高度的有效性， 并可持續(xù)幾個月，基本符合抑郁模型的要求，在目前國外文獻中廣泛使用。鼠類偏愛于甜的溶液，慢性應激經(jīng)常減少蔗糖的攝取。 這種糖偏好的減少被解釋為快感缺乏，這是抑郁癥診斷的一個核心癥狀，強制游泳實驗和懸尾實驗是*常用的兩個用于致抑郁劑和抗抑郁劑研究的實驗

回 。小鼠在水中放棄游泳掙扎和在懸吊于半空中時放棄掙扎的狀態(tài)的時間總和稱為無動時間， 反應了小鼠“無助”的癥狀。 在本實驗中所使用的慢性應激模型導致小鼠體質(zhì)量減輕、 蔗糖攝取減少及明顯的懸尾實驗和強制游泳實驗中無動時間的延長，表現(xiàn)出抑郁樣癥狀。

本實驗中的另一個模型一 5-經(jīng)色胺損毀組， 在本實驗中所使用劑量的 5,7一 雙經(jīng)色胺經(jīng)側(cè)腦室注射后21 d， 接近 100% 地損毀了中縫背核中的5-經(jīng)色胺能神經(jīng)元，在中縫背核中只剩下少量不規(guī)則纖維。 其他的實驗中顯示中縫背核中5-經(jīng)色胺神經(jīng)元消失，而被星型膠質(zhì)細胞所充填。 近年來的研究認為膠質(zhì)細胞在抑郁癥的發(fā)病和**中也承擔重要角色，但是其具體作用目前尚在研究之中。

在 21 d 的生存時間中，5-經(jīng)色胺損毀組小鼠體質(zhì)量增加明顯緩于另外兩個對照組。 在蔗糖攝取實驗中，表現(xiàn)出蔗糖攝取的明顯減少，表明對獎賞的反應下降。 當然不能完全排除由于體質(zhì)量增加減慢帶來的攝取量的減少。而在強制游泳實驗和懸尾實驗中，“ 無動時間”的延長反映其“ 無助”的表現(xiàn)。 本實驗中小鼠模型在體質(zhì)量改變、蔗糖攝取實驗、懸尾實驗和強制游泳實驗中均表現(xiàn)出與慢性應激模型類似的行為學表現(xiàn)。

大量研究發(fā)現(xiàn)5-PI -色胺缺乏與抑郁心境、食欲減退、**、晝夜節(jié)律紊亂、***功能紊亂、性功能障礙、不能應付應激、活動減少等癥狀有關(guān)。 54 A r色胺活動的不足，是引起抑郁的高危因子;其依據(jù)包括:①5-經(jīng)色胺能活動的**經(jīng)常導致一些抑郁的癥狀:情緒，食欲，活動，性，認知障礙及**。②在志愿者研究發(fā)現(xiàn)干擾 5-9 色胺的合成或儲存可以引起抑郁門 ，尤其是有抑郁癥家族史的志愿者。 而抑郁癥患者**后，如果耗竭色氨酸，會增加在 12 個月中復發(fā)率。 對于用5-輕色胺特效的抗抑郁****后的患者，耗竭5-經(jīng)色胺而保留去甲腎上腺素也會引起復發(fā), ③抑郁患者出現(xiàn)5-經(jīng)色胺活動的異常，包括5-輕色胺前體一 L-色胺酸減少，5-經(jīng)色胺合成，釋放，重攝取及代謝的障礙，以及其突觸后受體的異常。 ④抗抑郁**，尤其是SSRI，往往是通過提高5-輕色胺含量而發(fā)揮作用。 現(xiàn)有的一些體內(nèi)外實驗也支持抑郁患者確實存在 5-經(jīng)色胺功能障礙， 例如抑郁患者血漿色氨酸水平低、腦脊液 5-經(jīng)色胺代謝物也低， **者額葉皮質(zhì)中5-色胺受體密度增高， 都說明抑郁癥與5-經(jīng)色胺關(guān)系密切 。

本實驗中兩種模型表現(xiàn)出相似的行為學改變，都復制出部分抑郁癥狀。 很多實驗結(jié)果顯示持續(xù)應激可以引起 5-經(jīng)色胺和促腎上腺皮質(zhì)素釋放**一 皮質(zhì)醇系統(tǒng)的改變。 但是在 5-經(jīng)色胺損毀組中的小鼠其體質(zhì)量改變、蔗糖攝取實驗、懸尾實驗和強制游泳實驗中的無動時間的變化比慢性應激小組的變化更顯著。 提示慢性應激引起抑郁的機制可能不止涉及 5- 色胺系統(tǒng)。 而5-經(jīng)色胺的減少的作用主要是導致抑郁癥狀，還存在抑制抑郁癥狀發(fā)生的其他因素。本實驗結(jié)果也提示后一模型可以模擬出抑郁癥的某些癥狀， 本實驗室正在應用此模型進一步研究 5-輕色胺含量的減少在抑郁癥發(fā)生中的作用。