摘要: 目的 研究新物體識別實(shí)驗(yàn)在 ICR 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力評價中的應(yīng)用效果。方法 將 40 只 ICR 小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為 4 組，方雌組( 方形行為箱雌性小鼠組) 、方雄組、圓雌組和圓雄組。按照相同的新物體識別實(shí)驗(yàn)流程，測定各組小鼠對物體的探索時間。結(jié)果 方雌組與方雄組，圓雌組與圓雄組比較，探索時間和對新物體的分辨比均無顯著性差異( P＞0. 05) 。方組( 方雌組+方雄組) 與圓組( 圓雌組+圓雄組)比較，對新物體的分辨比無顯著性差異( P＞0. 05) ，但圓組的總探索時間顯著長于方組( P＜0. 01) 。結(jié)論 進(jìn)行新物體識別實(shí)驗(yàn)時，性別不影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評價，選擇圓形行為箱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可更好地評價小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

動物的認(rèn)知功能需要通過對其學(xué)習(xí)記憶的情況 進(jìn)行評價，因此需要建立規(guī)范的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從 而準(zhǔn)確判斷其學(xué)習(xí)記憶的情況。根據(jù)嚙齒類動物具有喜 歡 探 索 陌 生事 物 的 天 性，Ennaceur 和 Delacour于 1988 年報道了一種非獎賞性的、簡單的認(rèn)知記憶實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀挛矬w與新位置識別實(shí)驗(yàn)，用于檢測嚙齒類動物的記憶能力。該模型根據(jù)動物對見過的熟悉物體和沒有見過的新物體的探究時間的長短來評價被測試動物的記憶能力，即當(dāng)被測試動物未遺忘環(huán)境中見過的熟悉物體時，便會用更多的時間探究沒有見過的新物體; 當(dāng)被測試動物遺忘了見過的熟悉物體，則動物對環(huán)境中沒有見過的新物體和見過的熟悉物體的探究時間應(yīng)基本相同。與其它動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法相比，新物體識別實(shí)驗(yàn)具有不需要外部推動力，只需要適當(dāng)?shù)挠?xùn)練即可完成，且具有實(shí)驗(yàn)時間短的優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的學(xué)者的關(guān)注。但由于新物體識別實(shí)驗(yàn)缺乏統(tǒng)一 的 實(shí) 驗(yàn) 標(biāo) 準(zhǔn)，使其應(yīng)用受到一定的限制。以往研究針對物體材質(zhì)、時間間隔等具體檢測條件進(jìn)行，但缺少對行為箱形狀的研究，為了進(jìn)一步規(guī)范該方法的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究針對新物體實(shí)驗(yàn)方法中的實(shí)驗(yàn)行為箱形狀對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行考察。

1、材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

健康 ICR 小鼠，8 周齡，40 只，雌雄各半，體質(zhì)量 24～26 g，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任 公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證 號: SCXK ( 吉) -2011- 0004］。遵照國家實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用指南，將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，控制溫度在( 22±1) ℃，12 h 明暗循環(huán)，自由采食和飲水，預(yù)飼期 1 周。

1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠自主活動儀和小鼠新物體識別實(shí)驗(yàn)箱。

1. 3 實(shí)驗(yàn)動物分組

ICR 小鼠 40 只隨機(jī)分為 2 組，每組 20 只，雌雄各半，即方組( n = 20) 和圓組( n = 20) 。各組按性別再次隨機(jī)分為 2 組，即方雌組( n = 10) 、方雄組( n = 10) 、圓雌組( n = 10) 和圓雄組( n = 10) 。

1. 4 新物體實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前 5 d，實(shí)驗(yàn)人員每天將小鼠放到手上撫觸5 min，消除小鼠的緊張恐懼感。實(shí)驗(yàn)前，通過小鼠自主活動儀篩選，剔除活動異常的小鼠( 活動過少、活動過多、轉(zhuǎn)圈等) 。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，先將小鼠放到實(shí)驗(yàn)室，讓其適應(yīng)環(huán)境 1 h，然后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

新物體識別實(shí)驗(yàn)包含三個階段( 圖 1) 。階段 1 ( T1) : 分別將小鼠單獨(dú)放入敞開的行為箱( 底邊長44 cm×44 cm 的方形行為箱或半徑為 25 cm 的圓形行為箱) 中，自由探索 5 min。探索完畢后將小鼠取出，放回飼養(yǎng)籠中。清理行為箱中小鼠的糞尿，75%酒精擦拭，消除異味。本階段在實(shí)驗(yàn)第yi天上午、下午分別進(jìn)行一次。階段 2( T2) : 分別在行為箱的兩個相對的區(qū)域中放入 2 個完全相同的物體( 物體 1 和 1’) ，再次將小鼠放入行為箱中探索 5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第er天上午進(jìn)行。階段 3 ( T3) : 物體 1 不變( 舊物體) ，物體 1’更換為物體 2( 新物體) ，再次將小鼠放入行為箱中探索 5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第er天下午進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均在上午 8 點(diǎn)至下午 5 點(diǎn)之間進(jìn)行。

采用SuperMaze動物運(yùn)動軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄分析 T2 和 T3 中小鼠分別探索 2 個物體的時間，其中探索物體 1 的時間記為 F，探索物體 1’或 2 的時間記為 N，探索兩個物體的總時間記為 F+N，計算小鼠對物體 1’和 2 的分辨比( discrimination ratio，DR) ［DR = N/( N + F) ×100%］。探索定義為小鼠面朝物體，鼻子與該物體的距離≤2 cm。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 21. 0 for windows 統(tǒng)計軟件包分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( x珋±s) 表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn); 組內(nèi)比較用配對 Student t 檢驗(yàn)。以 P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2、 結(jié)果

2. 1 小鼠性別對新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在 T2 階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動物對物體 1 和 1’的探究時間: ( 31. 16±16. 75) s，( 30. 97±16. 50) s; ( 30. 37± 15. 95) s，( 31. 73 ± 15. 10) s; ( 112. 33 ±48. 26) s，( 112. 50 ± 49. 76) s; ( 112. 61 ± 47. 93) s，

( 112. 32± 47. 10) s 基本相同( P ＞ 0. 05) ，在 T3 階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動物對物體 2 的探索時間顯著長于對物體 1 的探索時間( P＜0. 05) 見圖 2，但相同形狀的行為箱( 方形行為箱，圓形行為箱) 中不同性別小鼠對 2 號新物體的 DR 無顯著性差異 ( P＞ 0. 05)

2. 2 行為箱形狀對新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在 T2 階段，不同形狀行為箱中小鼠對兩物體在5 min 內(nèi) 探 索 時 間 ( 30. 76 ± 15. 93 ) s，( 31. 35 ± 15. 40) s; ( 112. 47 ± 46. 81) s，( 112. 41 ± 47. 16) s 的差異未達(dá)到顯著水平( P＞0．05) ; 在 T3 階段，小鼠對 2 號物體的探索時間顯著長于 1 號物體，但兩種形狀行為箱中小鼠對新物體的分辨比無顯著差異( P＞0．05) 見圖 4。T2、T3 兩階段中，圓形行為箱中小鼠對兩物體的探索總時間( 224. 88 ± 37. 05) s，( 229. 15±33. 38) s 顯著長于方形行為箱中小鼠對兩物體的總探索時間( 62. 11 ± 23. 30) s，( 65. 58 ± 22. 40) s( P＜0. 01)

3、討論

新物體識別實(shí)驗(yàn)是在模仿測試人類失憶癥的識別任務(wù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，評價的是嚙齒動物對物體的識別記憶能力。該模型是建立在嚙齒動物對新異物體的自發(fā)探索行為的基礎(chǔ)上，且該模型不像迷宮學(xué)習(xí)中必須剝奪動物飲食或在避免水淹動機(jī)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶，也不像被動回避測試中給予動物電擊等負(fù)性強(qiáng)化讓動物學(xué)習(xí)記憶。所以該模型Zui大的優(yōu)點(diǎn)就在于可以讓動物在完全自然的狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測試，能夠更好地模擬人類和靈長類動物的學(xué)習(xí)記憶行為。因此，該模型越來越多地用在評估藥wu對記憶的作用研究上。

在新物體實(shí)驗(yàn)方法的使用中，如何規(guī)范實(shí)驗(yàn)流程，建立實(shí)驗(yàn)動物行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)成了實(shí)驗(yàn)的核心問題。本實(shí)驗(yàn)通過比較采用不同形狀的行為箱進(jìn)行新物體實(shí)驗(yàn)時結(jié)果的差異，推斷行為箱形狀對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，T2 階段的兩個物體完全相同，且對于小鼠來說均為首ci接觸，因此各組小鼠對物體的 DR 值均在 50%左右，表明實(shí)驗(yàn)動物無位置偏愛異常發(fā)生，即實(shí)驗(yàn)動物對兩個不同位置上的相同物體興趣相同。T3 階段，小鼠對 2 號物體的探索時間顯著長于 1 號物體，說明實(shí)驗(yàn)中選用的新物體引起了小鼠的探索興趣，物體的選擇正確。

各行為箱中，雌雄小鼠對新物體的分辨比無差異，表明不同性別的實(shí)驗(yàn)小鼠對新物體的分辨程度相同，即性別不影響對新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 T3 階段中，不同形狀的行為箱中的實(shí)驗(yàn)動物均能對新物體顯示出積極的探索興趣，分辯比相似，表明行為箱的形狀差異不影響實(shí)驗(yàn)動物對新物體識別行為。但實(shí)驗(yàn)動物在兩種形狀的行為箱中的總探索時間存在差異，說明行為箱的形狀對實(shí)驗(yàn)動物的活動程度有一定的影響。這可能是由于方形行為箱的角落效應(yīng)造成的。

研究結(jié)果表明，雖然在兩種不同形狀的行為箱中進(jìn)行的新物體識別實(shí)驗(yàn)，動物對新物體識別結(jié)果無差異，但為了避免角落造成的實(shí)驗(yàn)動物活動能力降低現(xiàn)象的發(fā)生，我們認(rèn)為采用圓形行為箱進(jìn)行新物體識別實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鼫?zhǔn)確地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物對新物體的識別能力。