毛冬青改善血管性癡呆小鼠學習記憶作用的研究

摘要:

目的:觀察毛冬青提取物對血管性癡呆(V D)模型小鼠學習記憶能力的影響，探討其潛在的作用機制。

方法:采用反復夾閉、再通雙側頸總動脈同時尾靜脈放血的方法制備小鼠癡呆模型，隨后將小鼠隨機分為假手術組，模型組，尼莫地平對照組(30mg/kg)，毛冬青低、中、高劑量組(5,  10,  20 g/kg)，各組灌胃相應**10 mL/kg，連續(xù)35 d，從第30天開始進行行為學檢測，末次給藥后收集大腦樣本，HE染色觀察病理學變化、**組化法及W esten Blot法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達。結果與假手術組比較，模型組小鼠的恐懼記憶時間明顯縮短，大腦海馬區(qū)神經(jīng)元細胞病變嚴重，海馬區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達的比值降低，且主要分布于胞質。與模型組比較，各**組小鼠的恐懼記憶時間明顯延長，大腦海馬區(qū)的組織病變情況改善，且海馬區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達的比值顯著增加。

結論:毛冬青提取物可能通過上調Bcl-2蛋白表達，下調B ax蛋白表達，減少細胞凋亡，保護神經(jīng)細胞，從而改善血管性癡呆小鼠的學習記憶功能。

關鍵詞:毛冬青提取物;血管性癡呆;學習記憶能力;細胞凋亡

    隨著全球老齡化的出現(xiàn)，慢性**癡呆越來越引起人們的關注。其中，血管性癡呆是繼阿爾茨海默病之后誘發(fā)老年期癡呆的**大病因Czl，也是目前**可以預防的腦退化**類型。因此，研發(fā)有效預防及**VD的**具有重要的意義。毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根或葉，是我國南方常用中藥，具有****、消腫止痛、****等功效，大量研究表明，毛冬青的各類制劑對冠心病、腦血栓、血栓性脈管炎等心腦血管**均有顯著療效。本研究通過觀察毛冬青提取物對血管性癡呆小鼠學習記憶、海馬區(qū)病理變化及凋亡相關蛋白表達的影響，探討毛冬青改善血管性癡呆學習記憶的可能作用機制，為中醫(yī)藥防治VD提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物KM種小鼠，雄性，SPF級，體質量32一35 g，由廣東省實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002。實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境:溫度23一25℃;相對濕度(50士5)%，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.2**及主要試劑 毛冬青飲片分別購于康美藥業(yè)股份有限公司和廣州大翔藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青飲片300g，粉碎成粗粉，加入60%乙醇加熱回流提取2次，依次用6倍量和4倍量溶媒分別提取1.5 h和1 h,濾過后合并藥液，減壓濃縮至150 m L，即得PHRE儲備液，用時以蒸餾水稀釋至所需濃度。

    尼莫地平片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BJ24208;  SABC**組化染色試劑盒，博士德生物，批號:11C29C。p-actin抗體，b iow orld，批號:AP0060。 Bcl-2抗體，abeam，批號:ab182858。B ax抗體，abeam，批號:ab32503。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔工所lg（H十L），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號:III-0011;

1.3儀器

A U M 220D電子分析天平，日本S h in ad zu公司;超低溫冰箱，美國Thermo公司;制冰機，日本Sanyo公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機，中國中科中佳科技儀器有限公司;多功能酶標儀，美國P erk iti E lm er公司;CM 1950冰凍切片機， A SP200S脫水機，E G 1160包埋機，RM 2135切片機，ST5020染色機，D C 300光學顯微鏡，均為德國Leica公司;小鼠條件恐懼試箱、X R -XC404條件性恐懼分析系統(tǒng)，上海欣軟科技有限公司。

1.4分組、模型制備及給藥

取雄性KM種小鼠，采用頸總動脈結扎反復缺血再灌注的方法制備經(jīng)典VD模型:小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL}kgl)全身麻醉，分離雙側頸總動脈，用動脈夾阻斷其血流30 min，松開動脈夾恢復血流10 m in，重復3次。于第1次阻斷血流5min后，小鼠斷尾放血約0.3 m L，冷凝止血。第3次血流再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可縫合皮膚。假手術組小鼠僅暴露雙側頸總動脈同等時間即可縫合皮膚。造模后第2天，除假手術組外，將模型小鼠隨機分為5組，分別為模型組，尼莫地平對照組(30 mg/kg),  PHRE低、中、高劑量組(含生藥量5,  10,  20 g/kg }，每組12只。各組小鼠按l0mL/kg灌胃給藥，連續(xù)35 d，每天1次，假手術組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.5行為學檢測

1.5.1爬桿實驗 第30天給藥后2h，進行爬桿實驗測試。將一根長50 cm、粗1.5 cm的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用紗布包裹以防打滑，小鼠頭朝下放置于竹竿頂部，記錄小鼠爬完桿長全長所需時間。正式記錄評分之前，訓練小鼠爬桿3d，每日1次，確保每只小鼠學會爬桿。根據(jù)爬桿時間進行評分，若小鼠墜落評7分，不動評6分，40 s掉頭評5分，20 s掉頭評4分，爬完全長31一40 s者評3分，21一30 s者評2分，11一20 s者評1分，0一11 s者評0分。

1.5.2條件恐懼實驗 

給藥34 d后進行條件恐懼實驗，實驗分為兩個階段，**階段為恐懼訓練階段，即第34天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，從20 s開始給予聲刺激(75 dB ,  2000 H )，持續(xù)10 s，從25 s開始給予光刺激，持續(xù)5s，從28 s開始足部電刺激((0.8 m A) 2 s。共進行4個循環(huán)，間隔時間各為15 s。**階段為測試階段，即第35天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，場景與受訓階段場景一致，提供相同的聲、光等提示性信號，但不給予電擊，動物仍將會表現(xiàn)出恐懼反應，通過觀察動物的僵直時間來反映動物對恐懼的記憶能力。

1.6樣本采集

恐懼實驗結束2h后，每組隨機選取6只小鼠，腹腔注射3.5%水合氯醛（10 mL/kg}麻醉，通過心臟灌注4%多聚甲醛固定腦組織，灌注完成后，取腦組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠斷頭處死，迅速摘取大腦，分離海馬區(qū)，用于**組化及W estenl Blot檢測。

1.7HE染色觀察

固定好的腦組織經(jīng)修整、脫水、包埋、切片、HE染色、封片等程序后，使用光學顯微鏡觀察小鼠海馬組織CA 1區(qū)組織結構的變化。

1.8**組化檢測

Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達用T issue 0 C T-Freeze Medium包埋小鼠大腦并制作冰凍切片。嚴格按照SA B C**組化染色試劑盒說明依次固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SA B C孵育、DAB顯色、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，并用數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)碼照相及圖片分析Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達情況。

1.9Western Blot法檢測Bcl-2, Bax蛋白的表達

分離小鼠大腦海馬區(qū)組織，提取總蛋白，BCA試劑盒進行定量。取50 ug蛋白樣本，用15%的聚丙烯酞氨凝膠進行電泳80 V ,   20 m in，之后轉換為120V、80 min;然后采用濕轉法進行轉膜300 m A、1 h;TB ST洗膜10 m in ,  3次;5 %  B SA常溫封閉 4 h;4 0C孵育一抗過夜;TBST洗膜10 m in ,  3次;37 0C孵育二抗1 h;  TBST洗膜10 m in ,  3次;ECL進行發(fā)光，用ltu age L ab 3.0軟件對W estenl B lot成像圖進行分析，計算各組蛋白與內參(p-actin)的相對表達值。

1.10統(tǒng)計學處理方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x士s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者使用LSD檢驗;方差不齊者使用D unnett' s檢驗。

2結果

2.1各組小鼠爬桿評分比較 爬桿實驗用于評價各組間小鼠肢體協(xié)調能力的差異。評分結果顯示:假手術組、模型組及各給藥組間均無明顯差異(P > 0.05 )，表明本研究采用的VD造模方法對小鼠的運動及平衡能力沒有造成影響，見表1 ;

2.2PHRE對小鼠條件恐懼記憶的影響 與假手術組比較，模型組小鼠的僵直時間百分比顯著縮短((P<0.09，表明VD模型復制成功，小鼠的記憶能力下降。與模型組比較，尼莫地平組及PH R E中、高劑量組小鼠的僵直時間百分比明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.09，表明PH R E在10-20 g/kg范圍內對VD小鼠的記憶能力有明顯的改善作用，見圖1

2.3毛冬青提取物對VD小鼠大腦神經(jīng)元細胞形態(tài)的影響

病理組織學檢查顯示，假手術組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)及分布未見異常。與假手術組比較，模型組小鼠神經(jīng)細胞間質水腫，細胞核濃染、固縮，皮層神經(jīng)細胞明顯減少，且伴有大量膠質細胞增生，多處聚集成堆，大腦海馬CA 1區(qū)的錐體細胞大量缺失、變性、壞死，齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。與模型組比較，PH R E低、中、高劑量組和尼莫地平組小鼠的大腦神經(jīng)元病變情況有明顯改善，體現(xiàn)為膠質細胞增生減少，海馬CA 1區(qū)錐體細胞病變程度明顯減輕見圖2 ;

2.4**組化法檢測

VD小鼠海馬CA1區(qū)凋亡蛋白Bcl-2, Bax的分布和表達結果顯示，Bcl-2, Bax呈不連續(xù)的環(huán)狀或者片狀分布，主要在胞質表達。與假手術組比較，模型組的Bc}2和B ax蛋白表達明顯增加。與模型組比較，尼莫地平組及PH R E中、高劑量組的Bcl-2表達增加，B ax表達減少。表明VD模型小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡，而在尼莫地平或PH R E的干預下，凋亡現(xiàn)象減少，提示毛冬青提取物可以減少VD模型小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

2.5  Western Blot法檢測VD小鼠海馬區(qū)Bcl -2 ,Bax蛋白的表達 Bcl -2水平的升高和B ax蛋白的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，是**起保護作用的標志。Bcl -2 ,Bax的比值越大，則抗凋亡能力越強。結果顯示，與模型組比較，毛冬青提取物能提高VD小鼠海馬區(qū)Bc}2蛋白的表達水平，同時降低B ax蛋白的表達，即明顯升高Bcl -2 ,Bax的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD小鼠海馬區(qū)細胞的抗凋亡能力，從而對VD小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元起保護作用。

3討論

    本研究通過血流阻斷聯(lián)合放血法復制小鼠VD模型，經(jīng)過小鼠智能測試及病理學檢查證實模型制備成功。實驗結果表明，VD模型組小鼠恐懼記憶時間縮短，且腦部海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生損傷，而毛冬青提取物能夠明顯提高VD小鼠的恐懼記憶時間，降低VD小鼠神經(jīng)元細胞損傷的程度，結合其對凋亡蛋白Bcl -2 ,Bax的影響可以推斷，毛冬青通過抑制海馬CA1區(qū)的細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

    大腦海馬區(qū)損傷會引起血管性癡呆，從而導致認知功能障礙。海馬體與大腦記憶有關，并且對腦缺血敏感Cio7。大量實驗結果表明海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元細胞的死亡會引起嚙齒類、靈長類動物以及人類出現(xiàn)認知功能障礙。因此，海馬CA1區(qū)錐體細胞對學習和記憶能力至關重要，然而CA1區(qū)對腦缺血尤為敏感，會引起嚴重的學習和記憶功能退化。病理實驗結果表明，VD模型組小鼠的大腦海馬CA 1區(qū)錐體細胞大量缺失、變性、壞死，并且齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。毛冬青提取物可阻止CA1區(qū)錐體細胞缺失，從而起到保護海馬區(qū)神經(jīng)細胞，改善VD小鼠學習記憶的作用。

    細胞凋亡在缺血再灌注損傷中具有重要的作用,  Bcl -2 ,Bax屬于Bcl -2家族蛋白，調控細胞凋亡。Bc}2屬于抑凋亡蛋白，可以阻止細胞色素C從線粒體釋放到胞漿。B ax屬于促凋亡蛋白，通過移位到線粒體膜上促進細胞凋亡，促進細胞色素C的釋放。Bc}2通過平衡Bcl -2 ,Bax維持線粒體結構穩(wěn)定。結果表明，與假手術組比較，模型組小鼠海馬區(qū)Bcl -2與B ax蛋白表達均有所升高，可能為小鼠大腦間斷缺血后，促凋亡蛋白B ax表達增加，誘導細胞凋亡，同時由于細胞自身的保護機制，抗凋亡蛋白Bc}2表達反應性上調，發(fā)揮抑制凋亡的作用。由于Bcl -2 ,Bax的比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡，在VD小鼠模型中，B ax蛋白的表達占優(yōu)勢，從而導致海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡，海馬區(qū)形態(tài)受損，記憶力出現(xiàn)障礙;與模型組比較，毛冬青提取物能夠提高Bcl -2的表達，降低B ax的表達，從而顯著提高Bc}2啟ax的比值，使海馬CA1區(qū)細胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通過調節(jié)海馬CA 1區(qū)Bcl -2 ,Bax的表達，抑制CA1區(qū)的細胞凋亡，從而改善VD模型小鼠的學習記憶能力。

    毛冬青已被廣泛應用于心血管系統(tǒng)**的**，療效確切。近年來，也有學者深入探討毛冬青對腦組織損傷的保護作用。本實驗結果表明，毛冬青提取物在高劑量時，改善VD小鼠學習記憶障礙的效果與尼莫地平相似，可通過抑制VD模型小鼠的腦組織海馬區(qū)細胞凋亡來提高學習記憶能力，有望發(fā)展成為一種新的**血管性癡呆**。