摘要目的: 考察補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對更年期模型小鼠抑郁行為的保護(hù)作用，并考察其可能的機(jī)制。方法: 通過卵巢摘除建立更年期模型，補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒2g /kg、6g /kg、18g /kg 連續(xù)給藥4 周，通過小鼠曠場實驗、糖水消耗實驗、懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗觀察小鼠抑郁行為，高效液相色譜法測定小鼠前額葉皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平。結(jié)果: 行為學(xué)檢測結(jié)果顯示補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒6g /kg、18g /kg 劑量組能明顯改善更年期抑郁模型小鼠行為，明顯增加小鼠在曠場中央站立次數(shù)以及糖水消耗量，并且顯著減少小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間。腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測結(jié)果顯示，補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒18g /kg 劑量組能明顯增加5-HT 和DA 含量。

結(jié)論: 補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒預(yù)防給藥可以改善更年期模型小鼠的抑郁行為，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞補(bǔ)陰消郁湯; 更年期抑郁; 行為學(xué); 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

抑郁癥作為一種慢性**已經(jīng)影響了上百萬人的正常生活，并且對抑郁癥患者家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。抑郁癥在更年期女性人群中發(fā)生率高，其發(fā)生率可達(dá)20%，嚴(yán)重影響更年期女性的社會行為，并且處于更年期時期的女性抑郁和**傾向的行為發(fā)生率均明顯高于同齡男性。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切的發(fā)病機(jī)制目前還未明確，有研究認(rèn)為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對抑郁癥的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用，且這一觀點在抗抑郁的**中得到了驗證。目前臨床上的抗抑郁**一般為影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的**，雖然這些**有一定的**作用，但大多起效較慢，同時存在明顯的**反應(yīng)。因此開發(fā)更**、有效的中藥**已經(jīng)成為一種臨床**抑郁癥的有效途徑。

二至丸是根據(jù)節(jié)氣命名的典型方劑，需要用冬至采收的女貞子、夏至采收的旱蓮草加工而成，故名" 二至丸" ，具有滋陰涼血、補(bǔ)益肝腎之功。綜合考慮在傳統(tǒng)二至丸中加味加入梔子、黃芩、甘草改方名為補(bǔ)陰消郁湯，目前，補(bǔ)陰消郁湯對更年期抑郁小鼠的**作用還未有報道，本文研究補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對更年期抑郁小鼠模型的**作用，并觀察補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。

1 材料和方法

1． 1 試驗**補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒: 每劑含量: 旱蓮草( 1507001W) 20 g，女貞子( 1510003Y) 20 g，梔子( 1508001S) 10g，黃岑( 1506001W) 10 g，甘草( 1506001S) 5 g。全部**均由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。給藥前，將一劑補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒加入32． 5 ml 煮沸的蒸餾水溶解，配制成2 g /ml 的母液備用。

氟西汀: 百憂解，PATHEON FＲANCE( 法國) 公司生產(chǎn)，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號: 5197AA。1． 2 動物SPF 級雌性昆明小鼠70 只，體質(zhì)量18 ～ 22g，動物合格證號: SCXK( 渝) 2012-2015，飼養(yǎng)與SPF 級實驗室，室內(nèi)環(huán)境溫度控制在25 ± 2 ℃，相對濕度為40% ～ 70%，光照時間為12h /12h 明暗交替。實驗期間動物自由攝食飲水。1． 3 試劑5-HT 標(biāo)準(zhǔn)品、DA 標(biāo)準(zhǔn)品、2，4-二硝基氟苯( DNFB)均購于Sigma-Aldrich 公司。

1． 4 儀器XＲ-XZ301 曠場實驗裝置，XＲ-XX203 懸尾試驗觀察箱，XＲ-XQ202 小鼠泳池，XＲ-Xmaze-1 動物行為分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ; Agilent 高效液相色譜儀( 包括自動進(jìn)樣器、UV 檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) ，Hypersil ODS2 填料色譜柱( 大連伊利特分析儀器有限公司) 。1． 5 方法小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)7d 后隨機(jī)選取50 只小鼠將進(jìn)行雙側(cè)卵巢手術(shù)摘除。卵巢摘除手術(shù): 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠( 4ml /kg) ，于俯臥位固定，用酒精棉球擦拭**背部皮膚，在小鼠大腿根部稍上方水平，脊柱旁約1 cm 處用剪刀剪開一個與脊柱呈平行狀態(tài)的長5 mm 左右的切口，剝離黏膜及下方腰肌，剝離包繞卵巢的脂肪組織，將粉紅色的卵巢輕輕拉出切口，在卵巢兩側(cè)結(jié)扎并小心摘除卵巢，縫合皮下及皮膚層關(guān)閉腹腔。隨機(jī)選取10 只小鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組不切除卵巢，僅打開腹腔后，摘取少許脂肪組織后關(guān)閉腹腔。

70 只小鼠隨機(jī)分為7 組，分別為空白對照組、假手術(shù)對照組、模型組、補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒2 g /kg、6 g /kg、18 g /kg 劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 劑量組。其中空白對照組小鼠不做任何處理，假手術(shù)對照組小鼠進(jìn)行假手術(shù)操作，其余小鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)。所有小鼠于手術(shù)1 周后開始給藥，給藥組均按相應(yīng)的給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥，體積為0． 2 ml /10g，空白對照組、假手術(shù)組和模型對照組采用相同的給**法，分別給予相同體積的對照溶劑。每日灌胃給藥，連續(xù)給藥4 周。

1． 5． 1 小鼠外貌評分的標(biāo)準(zhǔn)外貌打分實驗用來檢測動物日常的修飾行為，實驗方法參考已發(fā)表的文獻(xiàn)的方法。具體方法如下: 選取小鼠頭部、頸部、背部、尾部、爪子5 個部位作為檢測部位，每隔3 天觀測以上5 個部位同一區(qū)域的的毛發(fā)梳理情況。毛發(fā)呈現(xiàn)正常狀態(tài)、順滑有光澤、未出現(xiàn)惡化的物理狀態(tài)則評為0 分，毛發(fā)出現(xiàn)異常的狀態(tài)( 如粘有糞便、分泌物等) 、雜亂無光澤、出現(xiàn)惡化的物理狀態(tài)( 如脫落、打節(jié)) 則評分為1 分，每只小鼠的日常修飾行為用以上5 個部位的評分之和進(jìn)行評估。1． 5． 2 自主活動實驗分別于給藥前、給藥2 周后和給藥4 周后進(jìn)行小鼠自主活動實驗。將小鼠置于正方形開放視野實驗箱內(nèi)，實驗箱尺寸為80 cm × 80 cm × 75 cm( 長寬高) ，底板用筆畫成10 cm × 10 cm 的方格。室內(nèi)隔音，用視頻采集記錄系統(tǒng)記錄小鼠活動行為，每只小鼠測試時間15 min，測試完成后用動物行為分析系統(tǒng)進(jìn)行測試結(jié)果分析。

1． 5． 3 曠場實驗分別于給藥前、給藥2 周后和給藥4 周后進(jìn)行小鼠曠場實驗。將小鼠從籠內(nèi)取出，放置于曠場實驗裝置的中央，并迅速關(guān)閉上蓋( 應(yīng)避免產(chǎn)生聲響影響小鼠) ，打開錄像記錄系統(tǒng)，并記錄小鼠5 min 內(nèi)在曠場內(nèi)的活動，包括小鼠在曠場中心活動時間，直立次數(shù)( 前肢離地1cm 以上) 。實驗應(yīng)在黑暗的環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，裝置上方約1 m 處放置60w 燈泡，避免在裝置內(nèi)產(chǎn)生陰影。每只小鼠實驗后用酒精清潔裝置，以消除留下

的氣味。

1． 5． 4 糖水消耗實驗分別于給藥前、給藥2 周后和給藥4 周后進(jìn)行小鼠糖水消耗實驗。小鼠禁食禁水18 h 后，每只小鼠單籠飼養(yǎng)并給予2 個喂水瓶，每瓶裝入100 ml 飲水，1瓶內(nèi)裝1%蔗糖水，1瓶內(nèi)裝白水。實驗于晚8 點開始，到**天早8 點結(jié)束。實驗結(jié)束后記錄各瓶中剩余水量，計算出小鼠消耗糖水占總消耗水量的百分比即糖水偏好。

1． 5． 5 懸尾實驗小鼠倒掛于懸尾支架上時，小鼠頭部會上下左右活動，尋找可以攀爬的地方，經(jīng)過一段時間后會因失望而導(dǎo)致活動次數(shù)減少，出現(xiàn)間斷性不動現(xiàn)象。小鼠于末次給藥1 小時后進(jìn)行懸尾實驗。將小鼠尾末端2 cm 處用透明膠帶固定于懸尾箱的金屬棒上，使小鼠呈倒掛懸空狀，頭部離箱底50cm。小鼠倒掛6 min，開始2 min 為適應(yīng)時間，記錄后4 min 內(nèi)小鼠不動時間。

1． 5． 6 強(qiáng)迫游泳實驗小鼠放進(jìn)圓桶中后會出現(xiàn)掙扎試圖攀爬的行為，開始時，會盡力游泳試圖逃脫，但隨著未能逃脫，很快轉(zhuǎn)變?yōu)槠〔粍訝顟B(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動水面，以保持身體呈漂浮狀態(tài)，這種情形是動物放棄逃脫的希望的表現(xiàn)，屬于行為上的絕望。小鼠于末次給藥后1 h，將小鼠放置于水溫( 25 ± 1) ℃、水深15 cm 的圓桶內(nèi)游泳，連續(xù)游泳6min，開始2 min 為適應(yīng)時間，記錄后4 min 內(nèi)小鼠累計不動時間。

1． 5． 7強(qiáng)迫游泳實驗小鼠放進(jìn)圓桶中后會出現(xiàn)掙扎試圖攀爬的行為，開始時，會盡力游泳試圖逃脫，但隨著未能逃脫，很快轉(zhuǎn)變?yōu)槠〔粍訝顟B(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動水面，以保持身體呈漂浮狀態(tài)，這種情形是動物放棄逃脫的希望的表現(xiàn)，屬于行為上的絕望。小鼠于末次給藥后1 h，將小鼠放置于水溫( 25 ± 1) ℃、水深15 cm 的圓桶內(nèi)游泳，連續(xù)游泳6min，開始2 min 為適應(yīng)時間，記錄后4 min 內(nèi)小鼠累計不動時間。

1． 5． 7 小鼠腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量測定行為學(xué)實驗結(jié)束后小鼠取腦，分離前額葉皮層和海馬，稱重。組織按照1g: 7．5 ml 比例加入組織裂解液，冰浴上超聲勻漿破碎。4℃ 離心15min，取上清液加入等體積的高氯酸沉淀劑。冰上靜置10min，4℃離心15min，取上清液，于濾膜過濾后備用。進(jìn)樣量為10 ul，流速為1． 0 ml /min，發(fā)射波長為330 nm，激發(fā)波長為280 nm。分別檢測前額葉皮層和海馬內(nèi)5-HT 和多巴胺含量。

2 結(jié)果

2． 1 補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對卵巢摘除抑郁模型小鼠體重增長的影響各組小鼠體重在給藥前沒有顯著性差異，給藥后，模型組小鼠與空白組相比，在給藥2 周后和給藥4 周后小鼠體重增長值均明顯減少; 假手術(shù)組小鼠體重增長值在給藥2 周和4周后與空白對照組相比均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯6 g /kg 劑量組、18 g /kg 劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 給藥組在給藥4 周后體重增長值與模型組相比明顯增加，如表1 所示。

2． 2 補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對卵巢摘除抑郁模型小鼠外貌評分的影響小鼠外貌評分結(jié)果見表2，給藥前各給藥組外貌評分與模型組相比均無明顯差異。模型組小鼠與空白組相比，在給藥2 周后和給藥4 周后小鼠外貌評分均明顯增加; 假手術(shù)組小鼠外貌評分在給藥前、給藥2 周和4 周后與空白對照組相比均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯6， 18 g /kg 劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 給藥組在給藥2 周后和4 周后外貌評分與模型組相比明顯減少。

2． 3 補(bǔ)陰消郁湯對卵巢摘除抑郁模型小鼠曠場實驗中站立次數(shù)的影響小鼠曠場實驗結(jié)果見表3，給藥前各給藥組小鼠在曠場裝置中心區(qū)域停留的時間與模型組相比均無明顯差異。模型組小鼠在給藥前、給藥2 周后和給藥4 周后在曠場裝置中心區(qū)域停留的時間明顯少于空白對照組; 假手術(shù)組小鼠在曠場裝置中心區(qū)域停留的時間在給藥前、給藥2 周和4 周后與空白對照組相比均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯6， 18 g /kg 劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 給藥組小鼠在給藥2 周后和給藥4 周后在曠場裝置中心區(qū)域停留的時間較模型組明顯延長。

2． 4 補(bǔ)陰消郁湯對卵巢摘除抑郁模型小鼠糖水消耗量的影響糖水消耗實驗結(jié)果見表4，給藥前各給藥組小鼠糖水消耗量與模型組相比均無明顯差異。模型組小鼠在給藥前、給藥2 周后和給藥4 周后糖水消耗量均明顯少于空白對照組; 假手術(shù)組小鼠糖水消耗量在給藥前、給藥2 周和4 周后與空白對照組相比均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯6，18 g /kg 劑量組和氟西汀0．018 g /kg 給藥組小鼠在給藥2 周后和給藥4 周后糖水消耗量較模型組明顯增加。

2． 5 補(bǔ)陰消郁湯對卵巢摘除抑郁模型行為絕望實驗中不動時間的影響小鼠懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果見表5，給藥前各給藥組小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間與模型組相比均無明顯差異。模型組小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間與空白對照組相比均明顯延長; 假手術(shù)組小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間與空白對照組均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯6， 18 g /kg劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 給藥組小鼠在給藥2 周后和給藥4周后懸尾不動時間和游泳不動時間較模型組明顯縮短。

2． 6 補(bǔ)陰消郁湯對卵巢摘除抑郁模型小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞

質(zhì)含量的影響小鼠海馬及前額葉皮層內(nèi)5-HT 和多巴胺含量檢測結(jié)果見表6，結(jié)果顯示模型組小鼠海馬及前額葉皮層內(nèi)5-HT 和DA 含量均明顯低于空白對照組; 而假手術(shù)組小鼠海馬及前額葉皮層內(nèi)5-HT 和DA 含量與空白對照組相比均無明顯差異。補(bǔ)陰消郁湯18 g /kg 劑量組和氟西汀0． 018 g /kg 給藥組小鼠海馬及前額葉皮層內(nèi)5-HT 和DA 含量均明顯高于模型組。

3 討論

更年期是女性抑郁的高發(fā)時期，一般認(rèn)為是由于女性卵巢功能逐漸衰退誘發(fā)抑郁，因此本研究采用摘除卵巢小鼠建立小觀察到體重和自我修飾行為的減少，這兩個指標(biāo)可信度較高，易于觀察，重現(xiàn)性較好，在抑郁動物模型中得到廣泛的使用［10］。通過觀察這兩個指標(biāo)，確認(rèn)模型建立成功，并采用經(jīng)典的抑郁癥**篩選行為學(xué)實驗用于評價補(bǔ)陰消郁湯對小鼠更年期抑郁模型的**作用。

本研究選用其配方顆粒，配方顆粒具有質(zhì)量穩(wěn)定，便于調(diào)配，服用方便等諸多優(yōu)點。本研究結(jié)果表明補(bǔ)陰消郁湯能明顯改善抑郁模型小鼠的行為，表現(xiàn)為增加小鼠在曠場裝置中心區(qū)域的站立次數(shù)，增加糖水消耗量，明顯較少強(qiáng)迫游泳和懸尾的不動時間。上述結(jié)果從行為學(xué)角度證明了補(bǔ)陰消郁湯能有效的改善小鼠更年期抑郁樣行為。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為主要是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)，而多巴胺和5-HT 失調(diào)是抑郁發(fā)生的經(jīng)典假說。有研究證明，與正常人相比，抑郁癥患者額葉內(nèi)5-HT 受體功能下降，提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平能改善抑郁水平［11］。更年期患者體內(nèi)雌**下降，而雌**的降低影響腦部，5-HT 等神經(jīng)遞質(zhì)的含量［12］，本實驗研究結(jié)果顯示，卵巢切除模型小鼠前額葉皮層及海馬內(nèi)多巴胺和5-HT 水平均明顯降低，與文獻(xiàn)報道相符，而補(bǔ)陰消郁湯能有效提高抑郁模型小鼠前額葉皮層及海馬內(nèi)多巴胺和5-HT 水平，結(jié)果說明補(bǔ)陰消郁湯改善抑郁作用與調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。

也有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁發(fā)展過程中可見GABA 能和Glu 能突觸相關(guān)蛋白變化，神經(jīng)遞質(zhì)水平失調(diào)，從而影響神經(jīng)興奮性。同時，GABA 和Glu 的含量和比例與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)［13］，在下一步的研究中，擬進(jìn)行補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒對小鼠氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，如GABA 和Glu 的含量變化影響，進(jìn)一步考察補(bǔ)陰消郁湯的作用機(jī)制。

綜上所述，補(bǔ)陰消郁湯配方顆粒預(yù)防給藥可以改善更年期模型小鼠的抑郁行為，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量有關(guān)。