摘　要: 　目的　 觀察毀損黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大鼠行為學(xué)及其形態(tài)學(xué)變化特點, 探討兩者之間的相關(guān)性。 方法　利用62羥基多巴胺 (62OHDA ) 單側(cè)一點注射大鼠黑質(zhì)致密區(qū) (SN c) , 特異毀損多巴胺 (DA ) 能神經(jīng)元, 采用開野實驗觀察術(shù)后1d、 3d、 5d、 7d、 14d、 21d 行為學(xué)變化; 利用N issl 染色、H E 染色、**組織化學(xué)方法和電鏡的方法, 觀察各時間點黑質(zhì)形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果　毀損側(cè)DA 能神經(jīng)元逐漸減少, 超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重; 開野實驗中旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為在術(shù)后 1d 即有顯著改變 (與對照組比較 P < 0. 05) , 其中, 旋轉(zhuǎn)行為與毀損程度呈正相關(guān) ( r=0. 471 , P < 0. 01 ) , 探究、后肢站立和穿梭行為與毀損程度呈負(fù)相關(guān) ( r 分別為 - 0. 719、 - 0. 589、 - 0. 594, P <0. 01 ) , 修飾行為與毀損程度無相關(guān)性 (r= - 0. 227, P > 0. 05)。 結(jié)論　黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失是毀損大鼠行為改變的病理學(xué)基礎(chǔ), 開野實驗可作為丟失程度的敏感行為學(xué)觀察指標(biāo)。
關(guān)鍵詞: 行為; 　多巴胺; 　黑質(zhì); 　曠場實驗

眾多研究和臨床實踐表明, 腦內(nèi) DA 系統(tǒng)與動物的運動、學(xué)習(xí)、記憶、情緒等活動有密切關(guān)系。帕金森 病 (Park in son’ s disease, PD ) 就是原因不明的黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元變性丟失, 導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA 釋放量減少, 從而出現(xiàn)僵直、靜止性震顫和運動障礙等癥狀, 并伴有癡呆發(fā)生。目前 PD 大鼠模型大多以**誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗作為建模成功與否的觀察指標(biāo), 但此時黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失80% 左右, 紋狀體DA 含量下降超過 90% , 相當(dāng)于臨床 PD 晚期 [ 1 ]。利用開野實驗作為行為學(xué)觀察指標(biāo), 動態(tài)觀察黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化與行為改變之間的關(guān)系, 相關(guān)報道還不多見。本實驗利用 62OHDA 特異毀損大鼠單側(cè)黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元, 在不同時間點觀察DA 能神經(jīng)元的病理變化, 丟失比例和行為學(xué)改變, 分析兩者之間的相關(guān)性, 以期為 PD 早期模型提供行為學(xué)評價指標(biāo), 為 PD 早期病理改變和神經(jīng)生化研究提供指導(dǎo)。
1 　材料與方法
1. 1 　 儀 器 及 主 要 試 劑 　 腦 立 體 定 位 儀(上海欣軟信息科技有限公司) , 微量推進器 (N rish igeM O 281 日 本 產(chǎn) ) , 圖 像 分 析 系 統(tǒng) ( 江 蘇 捷 達(dá)) , 62OHDA (Sigm a)、酪氨酸羥化酶 (TH ) 抗體 (1 ∶ 500
Sigm a) , SABC、 DAB (武漢博士德)。
1. 2　實驗動物及分組　健康 Sp rague2D aw ley雄性大鼠 60 只 (安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供) ,體重 210～ 240g, 隨機分為正常對照組 (N C ) (n =10) , 實驗對照組 (EC ) (n = 10) , 和實驗組 (n = 40) ,后者按處死時間不同隨機分成 4 組, 每組 10 只。
1. 3 6-OHDA 毀 損 　 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350mg/kg) 麻醉大鼠, 頭顱水平位固定在腦立體定位儀上, 門齒溝平面比耳間線平面低2. 4mm , 剪去頭部毛, 切開頭皮, 暴露顱骨前囟點 (若不清晰, 可用3% H 2O 2 擦洗) , 參照包新民等 [ 2 ] 著《大鼠腦立體定位 圖 譜》確 定 右 側(cè) SN c 區(qū) 坐 標(biāo) 前 囟 后 (A P )- 5. 2mm , 右側(cè)旁開 (R ) 1. 3mm , 深度 (V ) 8. 0mm ,顱骨鉆孔后 (切勿損傷軟腦膜) , 1ul 微量注射器插入右側(cè)SN c 區(qū), 注射8g/L 6-OHDA (溶于0. 2%V itC 生理鹽水溶液) 1ul, 利用微量推進器緩慢推進 (0. 5ul/m in)。注射完畢, 留針5m in 后緩慢拔針, 縫合皮膚并肌注硫酸慶大霉素 (5mg/kg) 預(yù)防感染, 清醒后置籠喂養(yǎng)。 EC 組僅注射0. 2%V itC 生理鹽水溶液1ul, N C組不手術(shù)。
1. 4　開野實驗 /曠場實驗(open-field test) [ 3 ]  曠場箱100cm × 100cm × 40cm , 采用SuperMaze動物行為學(xué)軟件進行視頻分析，箱底劃為 25 個方格 (20 cm × 20cm ) , 將大鼠放入正中一格, 再點擊軟件開始記錄 15m in 內(nèi)各項行為指標(biāo)。 在毀損術(shù)后1 d、 3d、5d、 7d、 14d、 21 d 各觀察 1 次, 每次實驗均在 7: 00～12: 00AM 進行, 實驗室內(nèi)暗光、安靜, 兩次實驗之間將箱底打掃干凈。

1. 5　形態(tài)學(xué)觀察
1. 5. 1 　取材　分別在術(shù)后 1d、 7d、 14d、 21 d 行為學(xué)測試完畢, 7% 水合氯醛 (ip , 350mg/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盤上, 打開胸腔, 暴露心臟, 先用 0. 9%N aC l 100m l 經(jīng)心臟沖洗, 然后300m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出腦組織4% 多聚甲醛后固定24h。在針道旁 冠狀面切開, 石蠟包埋, 連續(xù)切片, 片厚 6um , 常規(guī)H E 染色。定位不在 SN c 區(qū)的大鼠從該組剔除, 不進行統(tǒng)計學(xué)分析。
1. 5. 2 N issl 染色　切片脫蠟至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15～20min, 95% 酒精快速分色 (2～ 3 s 即可) , 脫水、透明、封片、鏡檢。
1. 5. 3　**組織化學(xué)染色 (ABC 法) 　切片脫蠟至水后經(jīng) 3% H 2O 2 滅活內(nèi)源性過氧化物酶, 微波抗 原修復(fù) 2 次, 正常山羊血清封閉 20m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育過夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20m in。 其間, 各步驟間均用0. 01m o l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗滌, *后加 DAB 顯
色 (鏡檢控制顯色時間 ) , 常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。
1. 5. 4　電鏡觀察　灌注固定后, 分離黑質(zhì)和紋狀體約 1mm 3, 2. 5% 戊二醛、 1% 鋨酸雙重固定, 脫水, Epon812 包埋, L KB 2NOVA 切片機超薄切片,醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色, 日產(chǎn)JEM 21230 型透射電鏡觀察。
1. 5. 5　圖像分析　采用江蘇捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析, 根據(jù)N issl 染色圈出黑質(zhì)范圍, 采用同一放大倍數(shù) (× 100) , 同一光強度下測量陽性數(shù)密度, 并按照公式: 100- (右側(cè)細(xì)胞數(shù)/左側(cè)細(xì)胞數(shù)) × 100, 計算DA 能神經(jīng)元毀損程度。
1. 5. 6　統(tǒng)計方法　所有數(shù)據(jù)采用 X ± s 表示,SPSS11. 5 統(tǒng)計軟件進行分析, 采用單因素方差分析(ANOVA ) 進行組間比較, *小有意義差異 t 檢驗(L SD 2 t) 進行組內(nèi)兩兩比較, 開野實驗各參數(shù)與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元毀損比例作 Pearson’ s 相關(guān)分析。
2　結(jié)　果
2. 1 　開野實驗結(jié)果　見表  (1 ) 旋轉(zhuǎn)行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 05)。 在術(shù)后 1 d 右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為增多 (與對照組比較 P < 0. 05) , 3d、 5d 恢復(fù)到對 照組水平 (P > 0. 05, 與 1 d、 14d、 21 d 組比較 P <0. 05 ) , 而后右側(cè)旋轉(zhuǎn)又逐漸占據(jù)優(yōu)勢 (14d、 21 d 組與對照組比較 P < 0. 05) ; (2) 探究行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01 )。 術(shù)后 1d 較對照組大幅減少(P < 0. 01 ) , 3d、 5d 接近對照組水平 (P > 0. 05, 與1d、 7d、 14d、 21 d 組比較 P < 0. 01 ) , 此后逐漸降至較低 水平 (與對照組比較 P < 0. 01 ) ; (3) 穿梭距離: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01 )。 實驗組變化趨勢呈正態(tài)分布, 1d、 14d、 21d 組與 5d 組及對照組比較差異有顯著性 (P < 0. 01 ) , 5d 組與對照組比較差異無顯著性 (P > 0. 05) ; (4) 下肢站立: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01 )。 各實驗組與對照組比較差異均有顯著性 (P < 0. 01 ) ,3d、 5d 組也有恢復(fù)傾向 (與 1d、21 d 組比較 P < 0. 05) , 但與對照組相比仍處于較低水平; (5) 修飾行為: 變化沒有規(guī)律性, 組間比較差異無顯著性 (P > 0. 05)。
2. 2　形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果　見表 2。 (1 ) H E 染色和N issl 染色顯示, 從 1 d～ 21 d 大鼠 62OHDA 注射側(cè)SN c 區(qū)神經(jīng)元較對側(cè)明顯減少, 尼氏體著色較對側(cè)淡, 針道及毀損區(qū)可見不同程度膠質(zhì)細(xì)胞浸潤, 對照組左右側(cè)細(xì)胞數(shù)均無明顯變化。 (2) **組化染色顯示 (見圖 1～ 圖 5) , TH 陽性神經(jīng)元隨時間推移逐漸減少, 毀損比例不斷增大, 沒有恢復(fù)傾向, 對照組無明顯變化。 (3) 電鏡結(jié)果見圖 6～ 圖 8, 從1～ 21 d 大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重, 線粒體腫脹、嵴消失, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體也有腫脹; 21d 神經(jīng)元水腫, 游離核糖體減少, 溶酶體增多; 在紋狀體則有髓鞘松解斷裂, 突觸小泡多為清亮型, 顆粒小泡極少甚至看不見。
2. 3 　相關(guān)分析結(jié)果　旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元毀損比例呈正相關(guān) ( r= 0. 471, P < 0. 01 ) ; 探究行為、穿梭距離、下肢站立行為均與毀損比例呈負(fù)相關(guān) ( r= - 0. 719、 - 0. 594、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修飾行為與毀損比例無相關(guān)性( r= - 0. 227, P > 0. 05)。

3　討　論
DA 作為內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)作用于基底核 (basalganglia) 的D 1、 D 2 受體, 平衡調(diào)節(jié)基底核為中心的直接和間接神經(jīng)回路功能。 基底核并不發(fā)布對肌肉收縮的命令, 而是通過選擇不同的神經(jīng)元發(fā)放電活動,參與隨意運動的程序編制和運動程序的執(zhí)行, 在調(diào)節(jié)運動的組成、方向、順序、速度和幅度等方面發(fā)揮其作用。 PD 由于 SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元退變, 導(dǎo)致紋狀體DA 含量下降, DA 對間接回路的去抑制和對直接回路的興奮兩種功能嚴(yán)重喪失, 導(dǎo)致運動障礙。本實驗的結(jié)果也顯示, 實驗組大鼠在毀損術(shù)后 1 d 即有明顯行為學(xué)改變, 其中旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失比例有很好的相關(guān)性,而正常對照組和實驗對照組大鼠的行為在實驗前后沒有明顯改變。
腦內(nèi) DA 神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的代償功能, 如 PD患者在出現(xiàn)臨床癥狀時 SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元丟失已達(dá)80% 以上, PD 模型大鼠由于DA 受體超敏出現(xiàn)DA激動劑誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)運動等。 在我們的行為學(xué)實驗中也觀察到這種代償現(xiàn)象, 開野實驗的旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為指標(biāo)在術(shù)后 3d、 5d 有趨于改善的傾向, 其可能機制 [ 4～ 8 ]: (1 )DA 更新率增加, 殘存的DA 能神經(jīng)元合成和釋放DA 的能力增強; (2)DA 受體超敏, 包括受體敏感性增強和受體數(shù)目的增加;(3) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強, 如 Gs 蛋白上調(diào), A C 酶活力提 高, 細(xì) 胞 外 信 號 調(diào) 節(jié) 蛋 白 激 酶 (ex tracellu larsignal2 regu lated k inase, ER K) 的活化等。 我們的實驗未發(fā)現(xiàn)修飾行為與黑質(zhì)毀損比例有相關(guān)性, 但Berridge [ 9 ] 指出紋狀體在修飾行為的整合中起重要作用 , 如果毀損雙側(cè)紋狀體前外側(cè)部, 則將打破修飾行為鏈。因此, 我們認(rèn)為毀損一側(cè)SN c 區(qū)只能導(dǎo)致一
側(cè)紋狀體DA 含量下降, 而健側(cè)紋狀體足以發(fā)揮代償作用 , 保持修飾行為鏈的完整性。 另外, 可能與環(huán)境變化、手術(shù)損傷、麻醉等外界因素和觀察時間不夠也有一定的關(guān)系。6-OHDA 即 2. 4. 52三羥基苯乙胺, 是一種選擇性兒茶酚胺能神經(jīng)元化學(xué)毀損劑, 單獨或聯(lián)合注射到大鼠 SN c、內(nèi)側(cè)前腦束 (M FB )、紋狀體 (Cpu)、腹側(cè)被蓋區(qū) (V TA ) 等不同腦區(qū), 選擇性地毀損DA 和N E能神經(jīng)元 (尤其對前者作用更顯著) 制作不同程度損害的 PD 模型 [ 10 ]。其作用機制是: 62OHDA 通過多巴胺轉(zhuǎn)運體進入DA 能神經(jīng)元, 快速氧化生成氧自由基
(O 2 - 和 · OH ) , 抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物é , 并激 活 caspase 啟動細(xì)胞凋亡, 從而導(dǎo)致黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元丟失 [ 11, 12 ]。在我們的實驗中,6-OHDA SN c 區(qū)注射后 24h 即有 50% 以上的DA 能神經(jīng)元丟失, 而后隨時間推移毀損比例不斷增大。**組化切片經(jīng)N issl復(fù)染發(fā)現(xiàn), 非DA 能神經(jīng)元形態(tài)完整, 數(shù)量并不減少,在早期甚至有增多現(xiàn)象, 這說明 62OHDA 是一種實用可靠的特異性DA 能神經(jīng)毒劑。但該法制作的模型仍屬于急性損傷完全毀損模型, DA 神經(jīng)元在注藥后4h 即可見丟失。若用**誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗作為鑒定標(biāo)準(zhǔn), 一般為術(shù)后 2～ 3 周陽性, DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損已相當(dāng)嚴(yán)重, 不利于觀察輕中度毀損模型。 許多研究指出 , 對輕中度毀損模型的研究更有助于對臨床 PD 早期患者病理形態(tài)、神經(jīng)生化和輕度行為異常的了解,有 助于 PD 病因、發(fā)病機制和**、細(xì)胞移植及基因**的研究。因此, 建立一個敏感反映輕中度毀損的行為學(xué)觀測指標(biāo), 具有較大的現(xiàn)實意義。我們利用開野實驗對毀損早期的大鼠進行行為學(xué)的觀察, 發(fā)現(xiàn)術(shù)后 1 d 各項指標(biāo)即已發(fā)生明顯改變, 并能很好地動態(tài)反映DA 毀損程度。開野實驗不僅適用于輕中度毀損模型的觀測, 還能反映毀損早期機體的代償情況,并且各參數(shù)間可相互佐證, *大程度地減少主觀因素的影響。因此, 我們認(rèn)為開野實驗是一個很好的反映DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損程度的行為學(xué)觀察指標(biāo)。