摘要：目的 觀察消栓腸溶膠囊對中動脈栓塞大鼠新異性探索行為以及海馬微管相關蛋白２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ?。?，ＭＡＰ－２）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（ｂｒａｉｎ?。洌澹颍椋觯澹洹。睿澹酰颍铮簦颍铮穑瑁椋恪。妫幔悖簦铮?，ＢＤＮＦ）、β淀粉樣蛋白－４２（β－ａｍｙｌｏｉｄ－４２，Ａβ４２）表達的影響。方法　采用線栓法建立大鼠中動脈栓塞模型。將９０只大鼠隨機分成假手術組、模型組、消栓腸溶膠囊組（再按體質(zhì)量４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ分３個劑量亞組）、腦心通膠囊組（陽**物組），連續(xù)灌胃給藥１５ｄ，１次／ｄ。在造模第１５天進行曠場實驗；采用**熒光染色法檢測海馬ＭＡＰ－２和ＢＤＮＦ的表達；**組化法檢測海馬Ａβ４２的表達。結果 模型組大鼠在曠場中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)（四個角及四個邊）的活動路程減少；經(jīng)消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ**后，大鼠曠場活動總路程及邊緣區(qū)活動路程較模型組明顯增加（Ｐ＜０．０５）。和假手術組相比，模型大鼠海馬ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ表達下調(diào)，Ａβ４２表達增強（均Ｐ＜０．０５）；與模型組比較，消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ**組大鼠海馬ＭＡＰ－２表達明顯增強（Ｐ＜０．０５），消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ**組大鼠海馬ＢＤＮＦ表達升高，Ａβ４２表達降低（均Ｐ＜０．０５）。結論 消栓腸溶膠囊可提高腦缺血大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力，并通過提高內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，抑制Ａβ４２異常聚集，減少神經(jīng)元損害，增強海馬神經(jīng)元樹突的可塑性。

關鍵詞：消栓腸溶膠囊；腦缺血；曠場；微管相關蛋白２；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；β淀粉樣蛋白－４２　　

腦卒中后，患者不僅出現(xiàn)軀體殘疾，還可出現(xiàn)認知功能減退、情緒低落、興趣喪失、注意力下降、睡眠障礙、焦慮易激惹多種神經(jīng)精神癥狀。補陽還五湯為清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的**缺血性卒中后遺癥的中藥復方，對腦梗死引發(fā)的肢體功能障礙、認知障礙具有獨特的臨床療效。消栓腸溶膠囊是以補陽還五湯為組方的國家中藥保護品種，膠囊劑型解決了湯劑煎煮、攜帶不便的問題，同時藥品質(zhì)量可控，更好地適應了臨床需要。本實驗通過曠場實驗觀察中動脈栓塞大鼠探索新異環(huán)境的行為變化，評價消栓腸溶膠囊對腦缺血大鼠神經(jīng)精神癥狀的影響，并探討海馬微管相關蛋白２（ｍｉｃｒｏ－ｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?。穑颍铮簦澹椋睢。?，ＭＡＰ－２）、腦源性神經(jīng)營 養(yǎng) 因 子 （ｂｒａｉｎ?。洌澹颍椋觯澹洹。睿澹酰颍铮簦颍铮穑瑁椋恪。妫幔悖簦铮?，ＢＤＮＦ）、β淀粉樣蛋白－４２（β－ａｍｙｌｏｉｄ－４２，Ａβ４２）的表達及其作用機制，為腦卒中患者的康復**提供實驗依據(jù)。

１　材料和方法

１．１　實驗材料

?。樱校萍壭坌裕樱穑颍幔纾酰澹模幔鳎欤澹笫螅梗爸?，體質(zhì)量３００～３５０ｇ

，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動 物 合 格 證 號：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物中心ＳＰＦ級實驗室，動物實驗設施許可證號：ＳＹＸＫ（ＪＩＮＧ）２０１０－００２０。將大鼠隨機分為６組：假手術組、模型組、消栓腸溶膠囊３個劑量組（４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ）和陽性對照組（腦心通膠囊６００ｍｇ／ｋｇ），每組１５只大鼠。大鼠新異性探索行為及樹突重塑的影響機制

１．２　主要試劑和儀器

　包括消栓腸溶膠囊（三門峽賽諾維制藥有限公司），ＭＡＰ－２、Ａβ４２、ＢＤＮＦ（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司），腦心通膠囊（陜西步長制藥有限公司），山羊抗兔ｌｇＧ／ＤｙｌｉｇｈｔＴＭ４８８、山羊抗兔ｌｇＧ／Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４、兔超敏二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋公司），栓線（北京沙東生物技術有限公司），Ｅｃｌｉｐｓｅ生物顯微鏡、圖像采集分析系統(tǒng)（Ｎｉｋｏｎ公司），大鼠自發(fā)活動分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）。

１．３　方法

　１．３．１　大鼠中動脈栓塞模型制備：線栓法制備大腦中動脈栓塞長久性缺血模型。大鼠麻醉后，仰臥位固定，將栓線（直徑０．２６５ｍｍ，長４ｃｍ）置于頸內(nèi)動脈１８ｍｍ處，扎緊動脈殘端，縫合皮膚。假手術大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。術中、術后室溫控制在２４～２５℃之間，大鼠體溫維持在３６．５～３７．５℃之間。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)不能完全伸展左前肢、行走時向左側傾倒或轉圈者納為實驗對象。*終模型組１０只，消栓腸溶膠囊３個劑量組（４２０、１４０、４７ｍｇ／ｋｇ）分別為９只、９只、１２只，腦心通膠囊組８只，假手術組隨機選?。钢挥糜趯嶒?。

１．３．２　給藥：根據(jù)藥理實驗動物與人體臨床等效劑量換算關系確定消栓腸溶膠囊的給藥劑量。消栓腸溶膠囊的臨床用量為１．２ｇ／ｄ，即２０ｍｇ／ｋｇ（按６０ｋｇ／人折算），消栓腸溶膠囊大鼠用劑量１４０ｍｇ／ｋｇ（相當于臨床用劑量的７倍），４２０ｍｇ／ｋｇ（相當于臨床用劑量的２１倍），４７ｍｇ／ｋｇ（相當于臨床用劑量的３倍）。手術造模２ｈ后各干預組給藥１次，造模２４ｈ后再次灌胃給藥，連續(xù)給藥１５ｄ，每天１次。假手術組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

１．３．３　曠場實驗：大鼠中動脈栓塞第１５天進行曠場實驗。實驗在１個５４０ｃｍ×５９０ｃｍ×６９０ｃｍ的封閉箱中進行，箱子頂部中央安置有攝像機，將大鼠放置在箱子中心處，讓其自由活動５ｍｉｎ。采用自發(fā)活動分析系統(tǒng)記錄并分析大鼠活動總路程、中央?yún)^(qū)活動路程、四個角及四個邊的活動路程。大鼠新異性探索行為及樹突重塑的影響機制

１．３．４　取材與標本處理：動物行為學實驗結束后，各組隨機?。粗淮笫舐樽?，４％（質(zhì)量濃度）多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，恒定灌注時間６０ｍｉｎ，待固定充分，開顱取腦，將腦組織置大鼠腦模具固定，參照大鼠腦立體定位圖譜，切取視交叉后４ｍｍ組織塊，投入相同固定液于４℃固定１周后，常規(guī)石蠟包埋、切片。

１．３．５　ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ**熒光染色：腦組織切片經(jīng)檸檬酸緩沖液（ｐＨ６．０）高熱修復２０ｍｉｎ；１０％（體積分數(shù)）羊血清封閉１ｈ；經(jīng)兔抗ＭＡＰ－２（１∶７００）、ＢＤＮＦ（１∶１００）４℃孵育４０ｈ，每片滴加山羊抗兔（１∶８００），室溫孵育２ｈ后，０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ洗滌，ＤＡＰＩ封片。在激發(fā)／發(fā)射波長４７０／４９０ｎｍ條件下，ＭＡＰ－２陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光。在激發(fā)／發(fā)射波長５４０／５８０ｎｍ條件下，ＢＤＮＦ陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光。

１．３．６?。?/span>β４２**組織化學染色：腦組織切片經(jīng)檸檬酸緩沖液（ｐＨ６．０）微波修復２０ｍｉｎ；１０％（體積分數(shù)）羊血清封閉１ｈ；經(jīng)兔抗Ａβ４２（１∶５０）４℃孵育４０ｈ后，二抗試劑１孵育３０ｍｉｎ，試劑２孵育１ｈ；ＤＡＢ試劑顯色９０ｓ，中性樹膠封片。

１．３．７　圖像采集與分析：在Ｏｌｙｍｐｕｓ光學顯微鏡下觀察**染色切片，采集每張切片缺血側（右側）海馬ＣＡ１區(qū)相互不重疊的３個視野，采用ＮＩＳ－Ｅｌ－ｅｍｅｎｔｓ?。拢幔螅椋恪。遥澹螅澹幔颍悖鑸D像分析系統(tǒng)對ＢＤＮＦ、ＭＡＰ－２和Ａβ４２陽性表達進行分析，以積分吸光度（ＩＯＤ，ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?。铮穑簦椋悖幔臁。洌澹睿螅椋簦┓从酬栃员磉_的**強度。

１．４　統(tǒng)計學處理

　采用ＳＰＳＳ１１．５統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用ＬＳＤ檢驗。以Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng)計學意義。

２　結果

２．１　各組大鼠曠場行為學比較

　模型組大鼠曠場活動減少，在曠場中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)（四個角及四個邊）活動路程以及活動總路程均明顯少于假手術組（Ｐ＜０．０５）；經(jīng)消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、腦心通膠囊干預后，大鼠在曠場活動路程增加，特別是四個角及四個邊的活動路程顯著大于模型組（Ｐ＜０．０５）（表１）。

２．２　各組大鼠腦組織ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ和Ａβ４２的表達  具體結果見表２、圖１～３。假手術組大鼠海馬結構ＣＡ１－３區(qū)輻射層和腔隙層內(nèi)可見密集、叢狀的ＭＡＰ－２陽性神經(jīng)元突起，即樹突；Ａβ４２陽性表達主要位于神經(jīng)元核周體及周圍的軸突部位。與假手術組比較，模型組大鼠海馬ＣＡ１區(qū)ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ陽性細胞表達明顯減弱，Ａβ４２陽性表達增強（均Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，消栓腸溶膠囊中劑量組（１４０ｍｇ／ｋｇ）大鼠海馬區(qū)ＭＡＰ－２陽性細胞表達明顯增強（Ｐ＜０．０５），消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ、４　７ｍｇ／ｋｇ及 腦 心 通 膠 囊 組 大 鼠 海 馬ＢＤＮＦ陽性細胞表達明顯增強，而Ａβ４２表達明顯下調(diào)（均Ｐ＜０．０５）。

３　討論

　　新異性探索行為是動物對新環(huán)境新刺激表現(xiàn)出的興奮行為，體現(xiàn)了動物對新行為的獲得與發(fā)展、保持與再現(xiàn)的應激能力，屬于學習記憶過程。曠場行為實驗是比較經(jīng)典的動物行為學指標，能夠有效評價動物對新環(huán)境的探索、認知能力以及伴隨的抑郁、焦慮、緊張等情緒變化。此研究結果顯示中動脈栓塞１５ｄ模型組大鼠在曠場中央及周邊的活動較假手術組明顯減少，表明腦缺血損傷可降低大鼠對新環(huán)境的探究興趣，減少動物在新異環(huán)境中的探索行為。既往相關研究結果亦顯示，腦組織受損后，大鼠曠場活動路程減少，中央停留時間、跨格次數(shù)減少。這與該實驗結果一致。

　　海馬腦區(qū)與情緒、認知關系密切，中動脈栓塞后，不僅缺血中心區(qū)的結構功能發(fā)生明顯變化，在遠離梗死區(qū)的海馬也發(fā)生病理性改變。ＭＡＰ－２為神經(jīng)元樹突重塑的標志蛋白，對缺血損傷非常敏感，其活性下降可造成微管變性堆積，影響細胞骨架的完整，并可使線粒體的軸突轉運發(fā)生障礙，*終導致神經(jīng)元死亡。該實驗發(fā)現(xiàn)中動脈栓塞１５ｄ模型大鼠海馬腦區(qū)ＭＡＰ－２表達較假手術組明顯減弱，結合模型組大鼠曠場探索行為的變化，提示局灶性腦缺血會損傷遠隔腦區(qū)海馬樹突數(shù)量、結構和功能，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，*終導致認知功能損害及精神障礙。

　　補陽還五湯為臨床上**缺血性腦中風的有效復方。消栓腸溶膠囊為補陽還五湯經(jīng)現(xiàn)代工藝技術制備而成的膠囊劑。該研究發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可提高局灶性腦缺血大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力，增強ＭＡＰ－２的**活性，提高海馬神經(jīng)元樹突可塑性。大鼠新異性探索行為及樹突重塑的影響機制

　?。?/span>β、ＢＤＮＦ在神經(jīng)元損傷修復中的作用受到普通關注。Ａβ為β淀粉樣前體蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ?。穑颍澹悖酰颍螅铮颉。穑颍铮簦澹椋?，ＡＰＰ）的代謝產(chǎn)物。ＡＰＰ作為正常神經(jīng)元跨膜糖蛋白，由軸突的快軸漿運輸通道運輸，當軸索損傷，ＡＰＰ異常聚集并經(jīng)淀粉樣降解途徑代謝后可產(chǎn)生Ａβ４２，Ａβ４２具有神經(jīng)毒性，可促發(fā)炎性反應級聯(lián)反應，損傷軸突，導致突觸丟失。ＢＤＮＦ作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，主要在神經(jīng)元合成，經(jīng)軸突運輸，通過與其特異性膜受體酪氨酸激酶Ｂ（ｔｒｋＢ）結合，參與神經(jīng)元突觸的發(fā)育、存活、分化和軸突再生，在學習記憶中起重要調(diào)節(jié)作用。

　　本研究結果顯示，中動脈栓塞后，大鼠海馬ＢＤＮＦ表達明顯下調(diào)，Ａβ４２**反應增強，分析其原因可能為：腦缺血后，物質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)合成能力下降，神經(jīng)元細胞骨架崩潰，軸突運輸障礙，因而內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子ＢＤＮＦ合成、分泌不足，同時由于Ａβ４２聚集和沉淀，觸及多種神經(jīng)毒性機制，干擾腦內(nèi)神經(jīng)元突觸間的長時程增強作用而影響突觸的可塑性，影響學習記憶功能。

　　既往研究結果顯示，補陽還五湯可通過改善局部腦血流量和細胞能量代謝、抗血栓形成、促進軸索損傷后的修復，減輕神經(jīng)功能缺失，改善學習記憶功能。該研究進一步發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可明顯上調(diào)中動脈栓塞大鼠海馬腦區(qū)ＢＤＮＦ表達，降低Ａβ４２**陽性反應，提示消栓腸溶膠囊一方面可通過提高內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，保護受損神經(jīng)元；另一方面通過抑制Ａβ聚積和毒性作用，提高海馬神經(jīng)元樹突的可塑性，對改善腦梗后精神障礙具有積極的**意義。

　　該實驗選擇腦心通膠囊為陽**物對照，腦心通膠囊組方源于補陽還五湯，是在補陽還五湯的基礎上，增加水蛭、全蝎蟲類藥及丹參、當歸、紅花等**化瘀中藥組成的現(xiàn)代中**劑，具有****、化瘀通絡之效，為臨床**缺血性中風的常用中成藥。其有關藥理研究結果顯示，腦心通膠囊可降低血漿纖維蛋白原含量，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)及能量代謝障礙，對抗谷氨酸、自由基毒性損傷，減少細胞凋亡。此研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腦心通膠囊**后大鼠在新異性環(huán)境中的探索能力明顯增強，海馬腦區(qū)ＢＤＮＦ表達增加，Ａβ４２**陽性反應下調(diào)，但ＭＡＰ－２表達較模型組無統(tǒng)計學差異，而消栓腸溶膠囊１４０ｍｇ／ｋｇ組大鼠海馬ＭＡＰ－２表達較模型組明顯增強。而ＭＡＰ－２參與胞漿蛋白運輸和樹突生長，是腦缺血缺氧后神經(jīng)細胞受損及再生的指標之一。因此該研究結果提示，腦心通膠囊和消栓腸溶膠囊的作用環(huán)節(jié)可能并不完全一致，消栓腸溶膠囊促進海馬樹突重塑的作用可能較腦心通膠囊更具優(yōu)勢，其機制尚需進一步深入研究。由于本研究僅通過**熒光、**組化的方法觀察海馬腦區(qū)ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ、Ａβ４２的表達，實驗方法較單一，在后續(xù)實驗中應進一步利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測技術對海馬ＭＡＰ－２、ＢＤＮＦ，Ａβ４２蛋白進行定量檢測，通過多種技術手段和方法對消栓腸溶膠囊促進腦功能康復作用進行評價。