［摘 要］ 目的: 探討心理應(yīng)激狀態(tài)下咬**覺敏感增高現(xiàn)象與三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核( Vc) 內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系。方法: 健康雄性 SD 大鼠40 只，隨機(jī)分為: 空白對照組和應(yīng)激3、7、14 d 組( n =10) ，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)束縛應(yīng)激相應(yīng)時間后，采用曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠焦慮、抑郁樣情緒; VonFrey 絲刺激檢測各組大鼠咬肌的機(jī)械性痛閾; **組化染色和 Western－blot 檢測 Vc 內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白( GFAP) 表達(dá)的變化。結(jié)果: ①束縛應(yīng)激 7、14 d 組大鼠在曠場中央停留時間和中央活動總路程，以及在高架十字迷宮開放臂中的滯留時間百分比和進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比均較空白對照組明顯降低( P ＜0． 05) ; ②束縛應(yīng)激 7、14 d 組大鼠咬肌機(jī)械性痛閾均較空白對照組明顯降低( P ＜ 0． 05) ; ③束縛應(yīng)激 7、14 d 組大鼠 Vc 內(nèi) GFAP 的表達(dá)陽性率及其蛋白的表達(dá)水平均明顯高于空白對照組( P ＜ 0． 05) 。結(jié)論: 慢性束縛造成的心理應(yīng)激能導(dǎo)致 Vc 內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可能參與了心理應(yīng)激導(dǎo)致的咬**覺敏感性的增高。

［關(guān)鍵詞］心理應(yīng)激; 痛覺敏感; 三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核; 星形膠質(zhì)細(xì)胞; GFAP

頜面部咀嚼肌疼痛是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病*常見的癥狀之一，與精神心理因素有著密切的關(guān)系，本課題組前期研究表明心理應(yīng)激能夠?qū)е麓笫缶捉?*覺敏感性增高。近年來的研究顯示，延髓的三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核( Vc)既是頜面部信息整合的關(guān)鍵核團(tuán)，又是痛覺信息向**傳導(dǎo)的**門戶，而**神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了多種類型的疼痛，并與疼痛的惡化和維持密切相關(guān)。那么，Vc 內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激致咀嚼**覺敏感的過程中起怎樣作用，目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激所致咀嚼肌疼痛過程中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討心理應(yīng)激后口頜面疼痛的**機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1． 1 主要材料和設(shè)備

雄性 Sprague－Dawley 大鼠( 第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供) ; 自制束縛器; XR-XZ301曠場實(shí)驗(yàn)箱、XR-XG201高架十字迷宮 ( 上海欣軟信息科技有限公司) ; BCA 蛋白定量試劑盒( 上海西唐生物科技有限公司) ; 鼠單抗 GFAP、DAB 顯色劑、ECL 發(fā)光液( Abcam 公司，英國) ; 發(fā)光儀( Bio－Ｒad公司，美國) 。

1． 2 心理應(yīng)激動物模型的建立

取體質(zhì)量( 200 ～220) g SD 大鼠 40 只，隨機(jī)分為 1 個空白對照組和束縛應(yīng)激 3、7、14 d 3 個實(shí)驗(yàn)組，每組 10 只。然后參照文獻(xiàn)報道的方法對 3個實(shí)驗(yàn)組大鼠分別進(jìn)行束縛應(yīng)激處理 3、7、14 d，每天9 ∶ 00 ～17 ∶ 00 共8 h，應(yīng)激期間大鼠禁食禁水; 空白對照組大鼠不做任何處理。整個實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均在室溫( 22 ±2) ℃條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，每天光照 12 h，自由飲水、進(jìn)食。

1． 3 行為學(xué)測試

應(yīng)激結(jié)束后分別采用曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對各組大鼠的行為學(xué)進(jìn)行測試。每組實(shí)驗(yàn)完成后均徹底清理實(shí)驗(yàn)箱，并噴灑 750 mL/L 乙醇以消除大鼠殘留的氣味。

曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是評價大鼠**腦功能的重要實(shí)驗(yàn)。正常情況下，大鼠多傾向于沿著曠場的邊緣活動，但由于好奇心的驅(qū)使，大鼠又會向曠場中央進(jìn)行探索; 同樣在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠趨向于躲避在閉合臂，但也有向開放臂探索的情況。大鼠在曠場中央停留時間減少或進(jìn)入開臂次數(shù)減少或在開臂滯留時間縮短，即表明其出現(xiàn)了抑郁、焦慮等行為學(xué)異常的表現(xiàn)。

1． 3． 1 曠場實(shí)驗(yàn) ( Open field test)

分別于實(shí)驗(yàn)第 3、7、14 d 取各組大鼠放置于曠場實(shí)驗(yàn)箱( 規(guī)格為 100 cm ×100 cm × 80 cm) 的隔音房內(nèi)，并用弱光照明; 待大鼠適應(yīng)環(huán)境 5 min 后，將其放入曠場中央，記錄 15 min 內(nèi)每只大鼠在中央停留的時間( s) 、總路程( cm) 。

1． 3． 2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)( Elevated plus maze text)

待大鼠適應(yīng)環(huán)境 5 min 后，將其放入“十”字狀的中央并使面向閉合臂，記錄 5 min 內(nèi)每只大鼠進(jìn)入開放臂和閉合臂的次數(shù)以及停留時間。所得結(jié)果以每只大鼠在開放臂滯留時間的百分比( %) 和進(jìn)入開放臂次數(shù)的百分比( %) 表示。

1． 4 痛覺敏感度測定

分別于束縛應(yīng)激前( 作為基線) 和束縛應(yīng)激后1、3、7、14 d 各時間點(diǎn)，取空白對照組和各實(shí)驗(yàn)組大鼠，使用 Von Frey 纖維絲從細(xì)到粗依次對各大鼠的咬肌進(jìn)行刺激; 每一型號刺激 5 次，當(dāng)動物出現(xiàn)至少 3 次縮頭、避開、抬腿、發(fā)出聲音等行為時，即視為有痛覺反應(yīng)，并以該 Von Frey 纖維絲對應(yīng)的壓力值作為該動物的痛覺閾值。痛覺閾值降低，即說明其痛覺敏感度升高。

1． 5 心理應(yīng)激對 GFAP 表達(dá)影響的觀察

1． 5． 1 **組化染色檢測 GFAP 的表達(dá)水平

上述檢測結(jié)束后，取各組大鼠分別在 10 g/L****鈉過量麻醉( 50 mg/kg 腹腔注射) 下，用0． 1 mol / L 磷酸鹽緩沖溶液( PBS) 經(jīng)左心室快速灌注，沖凈血液后換用 4 ℃ 的 40 g/L 多聚甲醛溶液 300 mL 進(jìn)行灌注固定; 然后取各大鼠的腦干及頸髓，并以閂門平面為中心切取包括頭向 4 mm、尾向6 mm 的組織塊，放入 40 g/L 多聚甲醛液中 4 ℃下固定 4 ～6 h 后，再置于 300 g/L 蔗糖液中 4 ℃過夜。取固定后的各組織塊，分別進(jìn)行橫向連續(xù)冰凍切片( 厚 25 μm) 。取各組切片放入 0． 1 mol/L PBS中置搖床上漂洗3 次( 每次10 min) 后，滴加驢血清封閉 10 min; 滴加鼠抗 GFAP( 1 ∶ 700) 一抗，室溫、慢搖 24 h; 滴加驢抗鼠 ( 1 ∶ 500) 二抗，室溫、慢搖4 h，*后再滴加 AB 液 ( 1 ∶ 500 ) ，室溫、慢搖 1 h。以上每個步驟完成后均用 PBS 漂洗 3 次，每次10 min。取上述處理的所有切片，分別進(jìn)行 DAB顯色后，脫水、透明，中性樹膠封片; 顯微鏡下觀察并用計算機(jī)輔助成像分析裝置檢測各組相同部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的**陽性率( percent area occupiedby immuno—products( % ) )。

1． 5． 2 Western－blot 檢測 GFAP 蛋白的表達(dá)水平

斷頭處死各組大鼠，分別取其三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核，冰上孵育 10 min 后轉(zhuǎn)移至 1． 5 mL 的離心管中，超聲粉碎( 500 W) 5 s × 5 次; 10 000 r/min離心5 min，取上清并用 BCA 蛋白定量法測定總蛋白濃度。制備 12% 的分離膠和 4% 濃縮膠，然后取總蛋白以每孔20 μg 上樣進(jìn)行 SDS． PAGE 電泳( 濃縮膠80 V，分離膠 120V) 。電泳結(jié)束后，取適當(dāng)大小的凝膠和 PVDF 膜在50 V 電壓下轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果; 然后將 PVDF 膜置于50 g/L去脂奶粉中封閉2 h; 依次加入一抗 ( 1∶1000) 、二抗( 1∶1 000) 雜交，室溫下振蕩封閉; 化學(xué)發(fā)光顯色，并用 Quantity One 4．4 軟件對圖像進(jìn)行分析。以目的條帶與內(nèi)參 β－actin 條帶的灰度值之比作為該樣本中 GFAP 蛋白的相對表達(dá)量。

1． 6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 13． 0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)( x珋 ± s) 進(jìn)行one－way ANOVA 分析，兩兩比較用 SNK－q 檢驗(yàn); 疼痛閾值與 GFAP 活化水平的相關(guān)性采用 Pearson 相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0． 05。

2 結(jié)果

2． 1 行為學(xué)分析結(jié)果

2． 1． 1 曠場實(shí)驗(yàn)

隨著心理應(yīng)激時間的延長，大鼠曠場實(shí)驗(yàn)中的兩指標(biāo)均呈下降趨勢。其中應(yīng)激 7、14 d 組大鼠的中央停留時間與空白對照組相比均顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 1) ; 而應(yīng)激 14 d 組大鼠的活動總路程與空白對照組相比明顯降低( P ＜0． 05) ( 圖 2) 。

2． 1． 2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

隨著心理應(yīng)激時間的延長，大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的兩指標(biāo)均呈下降趨勢。其中，應(yīng)激 14 d組大鼠的開臂滯留時間百分比與空白對照組相比顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 3) ; 應(yīng)激 7 d 組、14 d 組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比與空白對照組相比均顯著

降低( P ＜0． 05) ( 圖 4) 。

2． 2 機(jī)械性痛閾測定結(jié)果

Von Frey 纖維絲痛閾測定結(jié)果顯示，隨著應(yīng)激時間的延長，大鼠咬肌疼痛閾值呈降低趨勢。其中應(yīng)激 7、14 d 組大鼠的咬**覺閾值與空白對照組相比均顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 5) 。

2． 3 心理應(yīng)激對 GFAP 表達(dá)的影響

2． 3． 1 **組化觀察結(jié)果

**組化染色結(jié)果顯示，空白對照組僅可見少量而散在分布的 GFAP 陽性細(xì)胞; 而應(yīng)激不同時間后，GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)均有所上升( 圖 6) ，且隨著應(yīng)激時間的延長上升越來越明顯; 其中應(yīng)激 7 d 組和應(yīng)激 14 d 組與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0． 05) ( 圖 7) 。

2． 3． 2 Western－blot 檢測結(jié)果Western－blot 結(jié)果顯示，心理應(yīng)激后 GFAP 蛋

白的表達(dá)量在應(yīng)激 7 d 和 14 d 組中有所升高，分別與空白對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異( P ＜ 0． 05)。圖 8 

2． 4 疼痛閾值與 GFAP 活化水平的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，大鼠咬肌的疼痛閾值與 Vc 內(nèi) GFAP **組化染色陽性率以及GFAP western － blot 相 對 灰 度 值 均 呈 負(fù) 相 關(guān)( P ＜0． 05) ( 表 1) 。

3 討論

束縛應(yīng)激是一種能引起典型非特異應(yīng)激表現(xiàn)的方法，該方法不僅可通過限制動物的活動自由而使之產(chǎn)生應(yīng)激，同時還能將應(yīng)激過程對軀體的創(chuàng)傷性減小到*低。因此，為避免創(chuàng)傷性應(yīng)激，本實(shí)驗(yàn)采用束縛應(yīng)激的方法建立心理應(yīng)激動物模型。行為學(xué)測試顯示，大鼠受到束縛應(yīng)激之后，在曠場中央?yún)^(qū)的停留時間、總路程以及進(jìn)入高架十字開臂的次數(shù)和停留時間等均隨應(yīng)激時間的延長而呈下降趨勢，表明大鼠出現(xiàn)了顯著的焦慮抑郁樣負(fù)性情緒; 并提示模型建立成功。

心理應(yīng)激是機(jī)體在某種環(huán)境刺激作用下，由于客觀要求和應(yīng)對能力不平衡所產(chǎn)生的一種緊張性反應(yīng)。當(dāng)今社會，面對日趨復(fù)雜和激烈的社會競爭，人們往往容易產(chǎn)生心理應(yīng)激，而心理應(yīng)激又與頜面部疼痛，尤其是口頜肌的疼痛有較大相關(guān)性。Diniz 等對 55 所中學(xué)即將高考的學(xué)生進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約有 50． 9%的人出現(xiàn)顳頜關(guān)節(jié)彈響、頜面部疼痛等與顳頜關(guān)節(jié)功能紊亂病相關(guān)的癥狀。另有研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激還可引起口頜肌肌電活動增加、肌緊張度升高、肌疼痛敏感度增強(qiáng)等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢性束縛的方法成功建立了大鼠心理應(yīng)激模型，并觀察到，應(yīng)激 7 d 和 14 d 組大鼠咬肌機(jī)械性痛閾值明顯下降( 疼痛敏感度明顯升高) ，與本課題組前期的研究結(jié)果一致。

三叉神經(jīng)脊束核 ( spinal trigeminal nucleus，STN，包括口側(cè)亞核 Vo、極間亞核 Vi、尾側(cè)亞核Vc) 是頜面部信息向**傳導(dǎo)的**門戶，是參與口頜面部傷害性信息傳遞的重要部位。Sara等研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激可使大鼠 Vc 內(nèi)的磷酸化環(huán)磷酯腺苷( cAMP) 反應(yīng)成分結(jié)合蛋白( pCＲEB) 及其下游基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，故 Vc 被認(rèn)為是心理應(yīng)激引起疼痛的**關(guān)鍵部位。有研究證明，舌下注射福爾馬林引起炎性舌**后，在 Vc 內(nèi)可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。Kohei 等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠咬肌注射完全弗氏佐劑( CFA) 后，Vc 中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物 GFAP 表達(dá)量增加。除上述炎性痛外，近年來還有研究證實(shí)，通過結(jié)扎大鼠 L5 脊神經(jīng)使之產(chǎn)生神經(jīng)病理性痛時，其脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)明顯活化。上述結(jié)果提示，無論在炎性痛還是神經(jīng)病理性痛情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞都會出現(xiàn)明顯的活化，且與痛覺敏感度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，大鼠經(jīng)慢性束縛應(yīng)激后，其 Vc 內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，且呈現(xiàn)出慢性化過程并與咬肌的痛覺敏感度相關(guān)聯(lián)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與疼痛的維持可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞 － 神經(jīng)元交互作用( crosstalk) 有關(guān)。有研究報道，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后可釋放各種炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素 1( IL －1) 、白細(xì)胞介素 6( IL －6) 、腫瘤壞死因子( TNF － α) 等，從而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并進(jìn)而使之惡化和維持疼痛。汪偉等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)病理性痛時，脊髓背角 GFAP 與 c－jun N 末端激酶( pJNK) 大量共存，小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物 CD11b 與 pp38 大量共存，且各自的表達(dá)均具有時空特異性，即小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷后數(shù)小時達(dá)到峰值，此后逐漸降低; 而星形膠質(zhì)細(xì)胞則在神經(jīng)損傷后數(shù)日至數(shù)周才逐漸活化并持續(xù)表達(dá)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)生中起重要作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的維持和惡化階段扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠 Vc 內(nèi)GFAP 的表達(dá)在建模 7 d 后明顯升高，且至少持續(xù)至 2 周，與上述結(jié)果相類似; 進(jìn)一步說明星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與介導(dǎo)了大鼠咬**敏的持續(xù)存在。

本課題組前期的研究主要集中于心理應(yīng)激后的外周水平，并觀察到大鼠經(jīng)心理應(yīng)激后其下丘腦 － 垂體 － 腎上腺皮質(zhì)軸興奮性增強(qiáng); 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽( CGＲP) mＲNA 的表達(dá)水平增加。以上結(jié)果提示，來自初級傳入的肽能纖維可能在 Vc 內(nèi)釋放增加并進(jìn)而激活**，即外周敏化引起**敏化; 而在此過程中位于 Vc 的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能發(fā)揮著重要的作用。

本結(jié)果提示，Vc 可能是調(diào)控心理應(yīng)激導(dǎo)致口頜面部疼痛的主要區(qū)域，而且 Vc 內(nèi) GFAP 的活化可能參與了心理應(yīng)激后痛覺過敏的發(fā)生; 但星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活或抑制是否能直接影響心理應(yīng)激后痛覺敏感的發(fā)生仍需要進(jìn)一步的研究。

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