摘要：目的 探討鷹嘴豆異黃酮提取物(CIE)對(duì)阿爾茨海默病(AD)炎癥模型大鼠記憶能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用脂多糖右側(cè)海馬注射制備 AD 模型，40 只 Wistar 大鼠隨機(jī)分為 CIE 高、中、低劑量組(100，50，25 mg·kg-1)、模型組和對(duì)照組(生理鹽水)，灌胃給藥 28 d 后，采用 Y-迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用**組化法檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和細(xì)胞白介素-6(IL-6)的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，嘗試次數(shù)均明顯增加(P<0.01)，TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)水平有顯著提高(P<0.01)；經(jīng)過(guò)灌胃給藥不同劑量的 CIE 后，與模型組相比，大鼠學(xué)習(xí)記憶的嘗試次數(shù)和 TNF-α、IL-6 的表達(dá)水平有不同程度的降低，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，特別在中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。結(jié)論 CIE 對(duì) AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的改善作用，其作用機(jī)制Y迷宮對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響

可能與抑制模型大鼠海馬組織內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)有關(guān)，進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆異黃酮提取物；阿爾茨海默??；腫瘤壞死因子-α；細(xì)胞白介素-6；海馬

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，其病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。有證據(jù)顯示，在 AD 發(fā)病初期及病程進(jìn)展過(guò)程中，海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)、神經(jīng)病理會(huì)發(fā)生一系列的變化，并在 AD 的發(fā)病與發(fā)展中具有重要作用。**神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)是 AD 的關(guān)鍵性特征之一，所涉及的多種炎性細(xì)胞因子加速了 AD 的整個(gè)病變過(guò)程，因此有研究提出，****可能延緩神經(jīng)元退行性病變的速度，或?qū)⒂欣诰徑?nbsp;AD 患者的癥狀。鷹嘴豆 Cicer arietinum L.屬于豆科，味甘、性平、無(wú)毒，具有補(bǔ)中**、溫腎**、潤(rùn)肺止咳等功效。有研究表明，鷹嘴豆具有廣泛的藥理活性，包括保護(hù)心血管、抗腫瘤、調(diào)脂等功能，這與其含有的活性成分異黃酮有著密切的關(guān)系，如芒柄花黃素、雞豆黃素 A。更有研究顯示，鷹Y迷宮對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響豆 異 黃 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract，CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制與其抗氧化能力有關(guān)。而 CIE 是否能通過(guò)影響 AD 病程的炎癥反應(yīng)及炎癥因子的表達(dá)，從而緩解 AD 的癥狀，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察 CIE 對(duì) AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探討其可能的機(jī)制，為抗 AD 的**研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的研究思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

成年 Wistar 大鼠 40 只，♂，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，清潔級(jí)，體質(zhì)量 200~250 g。

1.2 藥品、試劑與儀器

CIE 為自行制備，紫外分光光度法測(cè)得異黃酮含量為 39.0%；脂多糖(Sigma 公司，批號(hào)：B5-L2880)，用生理鹽水配成 5 μg·μL-1的溶液；TNF-α(批號(hào)：20130917)、IL-6(批號(hào)：20131025)、非結(jié)合多克隆兔抗體(批號(hào)：20131025)、S-P 試劑盒(批號(hào)：20130818)及 DAB 顯色試劑盒(批號(hào)：20120320)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；UV-3100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)； XR-XY1031 Y-迷宮刺激器(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀(美國(guó) Stoelting 公司)；JD801 圖像分析儀(江蘇捷達(dá)科技公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

將 Wistar 大鼠，♂，隨機(jī)分為 5 組：CIE 高、中、低劑量組(100，50，25 mg·kg-1)、模型組和對(duì)照組，每組 8 只，安靜清潔環(huán)境下 4 只一籠飼養(yǎng)，溫度控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度 60%，正常飲食。造模手術(shù)后第 2 天開(kāi)始，各試驗(yàn)組均灌胃給藥進(jìn)行干預(yù)，每日 1 次，模型組和對(duì)照組給予等量的生理鹽水。

2.2 模型制備

采用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，將其固定于腦立體定位儀上，剪去頭頂部毛發(fā)，碘酊**后切開(kāi)皮膚，參照《大鼠腦立體定位圖譜》選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū)，于前囟后 1.0 mm，中線旁開(kāi) 1.6 mm 處，用柔性顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器緩慢自腦表面垂直進(jìn)針 3.4 mm，將 5 μg·μL1的脂多糖溶液緩慢注入，2 min 后將注射針緩慢抽出，用骨蠟封住鉆孔，縫合切口。對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

2.3 Y-迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試

大鼠連續(xù)灌胃給藥 28 d 后，采用 Y-型迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分 2 次進(jìn)行，每次測(cè)試固定在上午 8：00~12：00，測(cè)試環(huán)境應(yīng)保持安靜，避光。第 1 次為學(xué)習(xí)能力測(cè)試：訓(xùn)練前，將大鼠放入 Y-迷宮自由活動(dòng)適應(yīng) 5 min，適應(yīng)后將Ⅰ臂作為**臂，Ⅱ、Ⅲ臂給予 60 V，0.5~0.7 mA的電刺激，持續(xù) 2 s，以大鼠被電擊后一次性逃離至**臂為正確反應(yīng)，否則判定為錯(cuò)誤反應(yīng)。之后的訓(xùn)練將**臂作為起始臂，將大鼠放置于**臂 1 min 加強(qiáng)記憶，**臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的順序依次改變，其他臂再次給予電刺激，依次類(lèi)推，以測(cè)試達(dá)到連續(xù) 10 次中有 9 次正確反應(yīng)所需的電擊次數(shù)作為評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。第 2次為記憶能力測(cè)試：學(xué)習(xí)能力測(cè)試后 48 h 后，以同樣的方法測(cè)試，以測(cè)試達(dá)到連續(xù) 10 次中有 9 次正確反應(yīng)所需的電擊次數(shù)作為評(píng)價(jià)大鼠記憶能力的指標(biāo)。

2.4 取材方法和樣品制備

在 Y-型迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試后，用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后剪開(kāi)胸腔，使心臟暴露，將灌流針從大鼠的左心室插入至升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，并同時(shí)快速灌注 37 ℃的生理鹽水至流出液清亮，然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注結(jié)束后迅速端頭取腦，去除嗅球和小腦，將組織放入 4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行后固定 6 h。固定后修腦，取包含海馬組織的腦區(qū)經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，切片備用，厚度為 4 μm。

2.5 大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)的檢測(cè)

大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)的檢測(cè)，按照博士德生物工程有限公司提供的**組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。切片制作完成后，每張切片隨機(jī)觀察 5 個(gè)高倍視野下的海馬區(qū)域，根據(jù) TNF-α和 IL-6 蛋白的表達(dá)，利用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)視野進(jìn)行灰度值測(cè)定并記錄結(jié)果

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以 x ± s表示，采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2 組間的比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及 Dunnett’s 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 CIE 對(duì) AD 模型大鼠 Y-迷宮學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在學(xué)習(xí)能力測(cè)試中，與對(duì)照組相比，模型組大鼠所需要的嘗試次數(shù)明顯增加(P<0.01)，說(shuō)明造模成功的 AD 大鼠學(xué)習(xí)能力降低。而灌胃給予不同劑量的 CIE 后，嘗試次數(shù)均有所下降，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，中、高劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。同樣在記憶能力測(cè)試中，模型組大鼠所需的嘗試次數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，與模型組比較，不同劑量 CIE 組的嘗試次數(shù)均有所下降，50 和 100 mg·kg-1劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且具有一定的劑量相關(guān)性。Y迷宮對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響

3.2 CIE 對(duì) AD 模型大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)水平的影響

經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)試顯示，模型組大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，提示模型組大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性；CIE 各劑量組 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相對(duì)于模型組有一定的提高，說(shuō)明TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)降低，且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表 2。

4 討論

AD 發(fā)病機(jī)制雖然復(fù)雜，但目前學(xué)界公認(rèn)炎性反應(yīng)在 AD 的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。有國(guó)外研究顯示，大量 TNF-α 等炎性細(xì)胞因子會(huì)存在AD 的神經(jīng)病例過(guò)程中，異常高度表達(dá)的 TNF-α提示其可能與 AD 的發(fā)病有關(guān)。IL-6 是一種炎癥性細(xì)胞因子，處于 AD **神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的中心位置，參與 AD 患者炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的形成。Sokolova 等通過(guò)大量試驗(yàn)表明，IL-6 在 AD 患者腦組織中呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，認(rèn)為 IL-6 具有神經(jīng)元毒性作用，參與 AD 的發(fā)病過(guò)程。與對(duì)照組相比，本研究中的模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶的嘗試次數(shù)明顯增加(P<0.01)，海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著降低(P<0.01)，提示表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，說(shuō)明AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，**神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)明顯，進(jìn)一步證明了該模型的可靠，可以用于炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的 AD 研究。鷹嘴豆由于富含具有較強(qiáng)抗氧化活性的異黃酮類(lèi)化合物，近幾年成為天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)。有研究表明，CIE 可能通過(guò)抗氧化機(jī)制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而氧化應(yīng)激不僅直接參與了 AD 的發(fā)病機(jī)制，更重要的是通過(guò)其連接中介效應(yīng)放大了 AD 神經(jīng)炎性病變的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，CIE 各劑量組TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相對(duì)于模型組有一定的提高，提示海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)降低，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。說(shuō)明 CIE 對(duì)海馬組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生有一定的抑制作用，在一定程度上阻斷了 AD 模型大鼠海馬內(nèi)的炎癥損傷，而產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。然而，CIE 是通過(guò)何種機(jī)制和通路對(duì) TNF-α、IL-6 等炎癥因子起

到精準(zhǔn)調(diào)控，需要進(jìn)一步地深入研究和探討。總之，CIE 對(duì) AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能與抑制大鼠海馬組織內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)有關(guān)，并進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)。