摘 要:目的:觀察4 周跑臺運(yùn)動對慢性應(yīng)激致抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，血漿皮質(zhì)醇(Cortisol，cort)含量和海馬 CA1 區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotro-phic Factor，BDNF)表達(dá)的影響。方法:30 只 SD 大鼠隨機(jī)分為正常對照組、應(yīng)激模型組及應(yīng)激運(yùn)動組，制作慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型，用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶等行為學(xué)指標(biāo)的變化，放射**法測試大鼠血漿 cort含量，**組織化學(xué)結(jié)合圖像半定量方法對海馬 CA1 區(qū)BDNF 神經(jīng)元的數(shù)量及面積進(jìn)行測量和分析。結(jié)果:慢性應(yīng)激致抑郁大鼠血漿 cort 含量增加，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長，工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)及總記憶錯(cuò)誤次數(shù)均顯著增加，海馬CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)減弱。而長期跑臺運(yùn)動可以顯著改善抑郁模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，血漿 cort 含量降低，海馬CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論:跑臺運(yùn)動可改善抑郁模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，機(jī)理可能與長期運(yùn)動降低抑郁大鼠的血漿 cort 水平、拮抗 HPA 軸功能亢進(jìn)及增強(qiáng)海馬CA1 區(qū) BDNF 的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:跑臺運(yùn)動;抑郁大鼠;學(xué)習(xí)記憶;BDNF

抑郁癥(depression)是一種潛在的致命的精神障礙性**，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)全球超過1.21 億人患有抑郁癥，它的發(fā)病與逐漸增大的各種壓力帶來的應(yīng)激性事件有關(guān)。慢性不可預(yù)知性應(yīng)激(Chronic UnpredictableStress，CUMS)是近年來國內(nèi)外應(yīng)用*為廣泛的抑郁動物模型之一，它可模擬抑郁的核心癥狀、快感缺乏及行為絕望，目前被廣泛運(yùn)用于抑郁癥的病理生理機(jī)制、抗抑郁**研發(fā)及作用機(jī)制的研究。研究發(fā)現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力降低是抑郁癥狀的重要表現(xiàn)，許多實(shí)驗(yàn)表明一定程度的應(yīng)激可以引起大鼠及人類學(xué)習(xí)記憶能力的減退，而運(yùn)動鍛煉能降低應(yīng)激導(dǎo)致的嚙齒動物的焦慮行為，改善動物的認(rèn)知功能，但機(jī)制尚不清楚。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是學(xué)習(xí)記憶和情緒整合的神經(jīng)**，其結(jié)構(gòu)損傷可能是抑郁癥患者情緒低落和學(xué)習(xí)記憶能力下降的基礎(chǔ)。BDNF(Brain DerivedNeurotrophic Factor)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一份子，對神經(jīng)元的發(fā)生、分化、存活和生長起著重要作用。近來研究顯示，BDNF 在抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)**的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，與焦慮、抑郁行為等有關(guān)。慢性應(yīng)激引起海馬形態(tài)學(xué)的改變研究較多的區(qū)域?yàn)楹ｑR CA3 區(qū)，較少涉及海馬 CA1 區(qū)，而且研究認(rèn)為海馬 CAl 區(qū)在動物的信息處理及空間記憶方面擔(dān)負(fù)著尤其重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以海馬 CA1 區(qū)為研究重點(diǎn)，通過復(fù)制 CUMS 大鼠模型觀察跑臺運(yùn)動4 周后血漿cort 水平，測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)的變化，探討跑臺運(yùn)動改善抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 動物及分組

雄性健康成年 SD 大鼠 3 月齡 30 只，體重(200 ～220)克，室溫(20 ± 2)℃，濕度(55 ± 10)% ，12 h 晝夜循環(huán)光照。大鼠購回后適應(yīng)環(huán)境1 周，將30 只大鼠隨機(jī)分為3 組:即正常對照組(C)、應(yīng)激模型組(SM)及應(yīng)激運(yùn)動組(SE)，每組10 只，SM 組及 SE 組大鼠單獨(dú)喂養(yǎng)。

1. 2 慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型

制備慢性中等不可預(yù)知應(yīng)激抑郁動物模型。應(yīng)激刺激為24h 禁水、5min 懸尾、2h 束縛應(yīng)激、5min 冷水強(qiáng)迫游泳(水溫 4℃)、24h 禁食、晝夜顛倒、20min 電擊足底(0. 8A，每次持續(xù)4s、間隔 5min)，共 7 種刺激，每日 1 種，每天1 次，以上刺激順序隨機(jī)安排，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，且每種刺激在每一輪中出現(xiàn)的次序不同，連續(xù)4 周。非應(yīng)激組大鼠除了必要的例行鼠籠清潔，不做任何干擾。

1. 3 跑臺訓(xùn)練方案

①應(yīng)激模型組大鼠從**周開始每天上午接受為期四周的 CUMS 程序。②應(yīng)激運(yùn)動組大鼠每天上午接受 1次 CUMS 程序，下午進(jìn)行跑臺訓(xùn)練。跑臺訓(xùn)練前大鼠進(jìn)行1 周適應(yīng)性訓(xùn)練，正式訓(xùn)練時(shí)，每天下午進(jìn)行跑臺運(yùn)動，大鼠0 坡度跑臺運(yùn)動4 周，第(1-2)周大鼠每天運(yùn)動30min(10m/min ×3)，第3 周每天運(yùn)動45min(15m/min ×3)，第4 周每天運(yùn)動 60min(15m / min × 4)，跑臺訓(xùn)練期間每個(gè)程序之間大鼠休息5min。跑臺訓(xùn)練時(shí)不使用電擊裝置驅(qū)趕大鼠，以避免對大鼠施加**應(yīng)激，為期4 周。③正常對照組:在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組大鼠除了必要的例行鼠籠清潔，不做任何干擾。

1. 4 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)程序

慢性應(yīng)激刺激及跑臺訓(xùn)練結(jié)束后**天，所有大鼠進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前大鼠先在迷宮中適應(yīng)2d，每天2 次。適應(yīng)時(shí) 3 至 4 只大鼠同時(shí)置于迷宮中，自由活動和攝取食物10min，適應(yīng)后進(jìn)行每天2 次的訓(xùn)練。每次訓(xùn)練中，八臂中只有四臂放置了食物(分別為1、3、5、7 號臂)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均維持此順序。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠禁食 2d，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)，中央?yún)^(qū)四周用鼠門關(guān)住，15s 后將門打開并開啟分析測試軟件，測試定時(shí)10min，大鼠可選擇進(jìn)入任意一臂，以攝取食物。大鼠進(jìn)入有食物的臂且攝取了食物為1 次正確選擇;分析記憶的記錄參數(shù)為錯(cuò)誤選擇的次數(shù)，重新進(jìn)入放食物臂或**次進(jìn)入放食物臂而不攝取食物為工作記憶錯(cuò)誤(workingmemory error，WME)，進(jìn)入不放食物臂稱為參考記憶錯(cuò)誤(reference memory error，ＲME)，兩者之和為總記憶錯(cuò)誤(total memory error，TE)當(dāng)大鼠將 4 臂食物吃完或 10min鐘后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，記錄所需時(shí)間(TT)。

1. 5 腦組織的取材及**組織化學(xué)染色

八臂迷宮行為測試結(jié)束后即刻，每組大鼠經(jīng)腹腔注射****鈉(40mg/kg)麻醉，開胸(同時(shí)心臟取血 2ml測血漿 cort 含量)，經(jīng)常規(guī)灌注固定，石蠟包埋后常規(guī)腦組織切片，片厚5μm，進(jìn)行 BDNF **組織化學(xué)染色(**組化檢測試劑盒為武漢博士德公司生產(chǎn))。將石蠟切片置于65℃烤箱中烤片1h，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，入3% H2O2－ 甲醇液，室溫孵育 30min，然后加入 BDNF 血清**抗體(兔 IgG，37℃孵育 1h)，0.1molPBS 洗 2min ×3，隨后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體37℃孵育1h;接著入ABC 液，37℃孵育 1h，DAB 呈色、蘇木素輕度復(fù)染、裱片、脫水、透明、封片。

1. 6 大鼠血漿 cort 含量測試

八臂迷宮行為測試結(jié)束后即刻，灌注同時(shí)從大鼠左心房抽取2ml，將從每只大鼠抽出的2ml 血液4℃、3000r/min 離心 10min，分離血漿，轉(zhuǎn)移至一新離心管，置于 －70℃低溫冰箱中保存，采用常規(guī)放射**法測定大鼠血漿cort 含量。

1. 7 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠海馬 CA1 的位置(圖1-2)，用數(shù)碼顯微鏡拍片，江蘇捷達(dá)形態(tài)學(xué)分析軟件對大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 陽性神經(jīng)元的表達(dá)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù) BDNF 陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及面積(400 倍)。采用 SPSSl8. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用 mean ± SD 表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVE)對組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以 P ＜0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，P ＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有高度顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 1 大鼠八臂迷宮行為學(xué)測試結(jié)果

表2 結(jié)果顯示:與正常對照組比較，應(yīng)激模型組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長(P =0.002)，工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)(WME)及參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)(ＲME)均顯著增多(P=0. 002，P =0. 043)，總記憶錯(cuò)誤次數(shù)(TE)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對照組(P =0.002);與應(yīng)激模型組比較，應(yīng)激運(yùn)動組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著縮短(P =0.021)，ＲME 及TE 均顯著增多(P =0.026，P =0.032)，WME 與應(yīng)激模型組大鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.061)。

2. 2 各組大鼠血漿 cort 結(jié)果

表3 所示，與正常對照組比較，應(yīng)激模型組大鼠血漿cort 含量顯著增加(P = 0. 003)，增加幅度為 97% ;經(jīng)過 4周跑臺運(yùn)動，應(yīng)激運(yùn)動組大鼠血漿 cort 含量顯著降低(P=0. 049)，下降幅度為 27% ，提示長期跑臺運(yùn)動可能通過拮抗慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的 HPA 軸功能亢進(jìn)，從而達(dá)到抗抑郁目的。跑臺運(yùn)動對抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試影響

2. 3 各組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)結(jié)果

從圖2 可見海馬CA1 區(qū)內(nèi)分布有大量BDNF，胞漿染色，胞核不染色，神經(jīng)元大小不一，呈散在分布，胞體形態(tài)多種多樣呈圓形或橢圓形，有的有較長的突起。

由表3 可知:與正常對照組比較，應(yīng)激模型組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF **陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著減少(P=0. 001，P =0. 002)，降低幅度分別為44%及45%;經(jīng)過4周跑臺運(yùn)動應(yīng)激運(yùn)動組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF **陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增加(P =0.035，P =0.024)，增加幅度分別為45%及58%。

3 討論

3. 1 跑臺運(yùn)動對抑郁模型大鼠血漿 cort 含量及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

下丘腦 －垂體 －腎上腺軸(HPA)涉及人體的多種生理功能和病理變化如情感、代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等，HPA軸功能障礙被認(rèn)為是情緒障礙的核心特征。當(dāng)機(jī)體感受應(yīng)激源時(shí)，HPA 軸興奮性提高，但若機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，將嚴(yán)重影響人體的身心健康，使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥狀。大量研究顯示，抑郁患者血漿的促腎上腺皮質(zhì)**和皮質(zhì)醇均濃度升高，而經(jīng)抗抑郁**后隨著抑郁緩解兩者濃度下降。本實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果，經(jīng)過4 周慢性不可預(yù)知應(yīng)激大鼠血漿 cort 水平均顯著增加，可能的原因，HPA 軸自身具有分泌**的功能，長期慢性應(yīng)激可以促使下丘腦分泌 CＲH，CＲH 進(jìn)一步刺激腦垂體分泌 ACTH，ACTH 刺激腎上腺皮質(zhì)**釋放糖皮質(zhì)**(cort)。cort是 HPA 軸重要**，過量的糖皮質(zhì)**能夠?qū)C(jī)體造成一定損害。研究認(rèn)為，cort 是 HPA 軸重要**之一，與絕望、焦慮情緒及認(rèn)知功能有關(guān)，而且 Ulloa 等研究發(fā)現(xiàn)嚙齒動物大腦重復(fù)注射 cort 可以引起動物抑郁樣及影響神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)。Ｒyan 等通過水迷宮證實(shí)束縛及冷水應(yīng)激21 天大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。本實(shí)驗(yàn)通過八臂迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠經(jīng)過4 周慢性不可預(yù)知的應(yīng)激，與對照組比較，應(yīng)激模型大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長，參考記憶、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)及總錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，與以前多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。

研究表明，運(yùn)動可以通過拮抗 HPA 軸功能亢進(jìn)改善抑郁大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。我們的研究也證實(shí)了此觀點(diǎn)，4 周跑臺運(yùn)動可以降低慢性應(yīng)激致抑郁模型大鼠皮質(zhì)醇的過度分泌，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激運(yùn)動組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間縮短，記憶錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。結(jié)合血漿皮質(zhì)醇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為跑臺運(yùn)動通過拮抗HPA 軸減少大鼠皮質(zhì)醇分泌可能是運(yùn)動改善抑郁癥大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損的機(jī)制之一。跑臺運(yùn)動對抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試影響

3. 2 跑臺運(yùn)動對抑郁模型大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)的影響

海馬是與學(xué)習(xí)記憶和情緒行為功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，也是應(yīng)激易累及損傷的靶區(qū)，其與抑郁障礙的關(guān)系近年來受到關(guān)注，臨床研究提示抑郁癥患者海馬表現(xiàn)出神經(jīng)元萎縮和壞死，采用 MＲI 發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者雙側(cè)海馬的體積明顯小于正常人，并且海馬萎縮的程度與抑郁癥的病程成正比。而且研究證實(shí)，應(yīng)激可以導(dǎo)致海馬 CA1區(qū)域的形態(tài)學(xué)改變，可能與海馬功能的損害有關(guān)。Sousa等發(fā)現(xiàn)不可預(yù)測的慢性應(yīng)激既使大鼠海馬 CAl 區(qū)錐體細(xì)胞樹突總長度減少13%，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。

神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF 在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，慢性不可預(yù)知的應(yīng)激是近年來國內(nèi)外應(yīng)用*為廣泛的抑郁動物模型之一，動物實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)激可以減少海馬 BDNF 的表達(dá)，而抗抑郁**可以阻止抑郁大鼠 BDNF水平的下降。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期慢性應(yīng)激組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)明顯減弱，同時(shí)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，可以推測慢性應(yīng)激導(dǎo)致的海馬 CA1 區(qū) BDNF減少可能是大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的病理機(jī)制之一。而應(yīng)激運(yùn)動組大鼠跑臺運(yùn)動4 周后海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示慢性應(yīng)激大鼠經(jīng)過長期跑臺運(yùn)動八臂迷宮成績提高可能與海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)?？赡艿脑?，海馬腦區(qū)是參與和調(diào)節(jié)應(yīng)激的主要結(jié)構(gòu)，應(yīng)激刺激的信息首先作用于海馬，并引起機(jī)體下丘腦促腎上腺皮質(zhì)**釋放因子(CＲH)的分泌導(dǎo)致 HPA 軸功能亢進(jìn)，大鼠皮質(zhì)醇分泌增加。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激引起的皮質(zhì)醇的分泌增多進(jìn)而損害海馬各個(gè)分區(qū)結(jié)構(gòu)及功能和 BDNF的表達(dá)。海馬 CAl 區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中擔(dān)負(fù)著尤其重要的作用，因此可以推測長期跑臺運(yùn)動增強(qiáng)慢性應(yīng)激大鼠學(xué)習(xí)記憶能力主要與此運(yùn)動拮抗 HPA 軸功能抗進(jìn)減少 cort分泌導(dǎo)致海馬 CAl 區(qū) BDNF 表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。跑臺運(yùn)動對抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試影響