【摘要】  目的 研究創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律變化。方法 經(jīng)過(guò)痛閾篩選的96只SD大鼠隨機(jī)分為12組,每組8只,其中每2組作為1個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),分別于8:00(ZT0)、12:00(ZT4)、16:00(ZT8)、20:00(ZT12)、24:00(ZT16)、4:00(ZT20)這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)用甩尾法測(cè)定動(dòng)物痛閾后,分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理:空白對(duì)照組(不截肢)、截肢模型組(截肢)。截肢后立即測(cè)定動(dòng)物的術(shù)后痛閾,計(jì)算截肢前后的痛閾改變率。結(jié)果 正常大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,明期痛閾較高,暗期痛閾較低;創(chuàng)傷痛大鼠痛閾明顯降低,尤其以早晨8點(diǎn)左右痛閾下降明顯。結(jié)論 痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,研究結(jié)果可為臨床選擇手術(shù)時(shí)機(jī)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】  時(shí)間生物學(xué);晝夜節(jié)律;痛閾

　　疼痛是多種**的共同病理表現(xiàn),過(guò)強(qiáng)的疼痛或長(zhǎng)期慢性的病理性疼痛,將引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的生理病理改變。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,在不同的時(shí)辰,機(jī)體對(duì)疼痛的反應(yīng)性的高低并不是恒定不變的。我們研究了創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律變化,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

　　1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　選用SD大鼠(SpragueDawley rat,Inbred strain),清潔級(jí)合格動(dòng)物,體重161.63 g±24.92 g,2月齡,雌雄各半,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第9號(hào))。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)10天,進(jìn)行痛閾篩選,其標(biāo)準(zhǔn)是:痛闡測(cè)定在5～15 s左右能引起甩尾反應(yīng)者用于實(shí)驗(yàn),凡痛閾值高于15 s或低于5 s者,表示動(dòng)物反應(yīng)遲鈍或過(guò)敏,則不納入實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)所有納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均痛閾為8.15 s±2.58 s.　　實(shí)驗(yàn)在成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間醫(yī)學(xué)測(cè)試室進(jìn)行,隔音、通風(fēng)、恒溫(22℃±1℃)、相對(duì)濕度60%～65%、自動(dòng)光暗控制。所有動(dòng)物均自由飲水?dāng)z食。馴養(yǎng)10天后用于實(shí)驗(yàn)。

　　1.2 主要器械及儀器設(shè)備

　　7360型疼痛甩尾痛閾測(cè)定儀(核定電壓220 V,頻率50 Hz,電流1.25 A,UGO BASILE S.R.L,Biological Research Apparatus,意大利)。

　　2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.1 動(dòng)物分組及處理

　　2.1.1 動(dòng)物分組

　　實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將經(jīng)過(guò)痛閾篩選符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的96只大鼠分別稱重后,將痛閾和體重作為雙重選擇指標(biāo),利用SPSS 12.0軟件,將動(dòng)物隨機(jī)分為12組,每組8只,雌雄各半。其中每2組作為1個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),分別于6個(gè)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同組的動(dòng)物進(jìn)行相應(yīng)處理。所有動(dòng)物提供8 am8 pm的人工光照,時(shí)間點(diǎn)分別為8am(ZT0,ZT即 zeitgeber time,為授時(shí)因子時(shí)間),12am(ZT4),4pm(ZT8),8pm(ZT12),12pm(ZT16),4am(ZT20)。

　　每次實(shí)驗(yàn)時(shí)注意控制聲、光等因素的干擾。動(dòng)物適應(yīng)性馴養(yǎng)10天后,于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的**天8～12點(diǎn)內(nèi)測(cè)定所有動(dòng)物的痛閾作為基礎(chǔ)痛閾;**天在以上6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)每16只大鼠進(jìn)行痛閾測(cè)定,測(cè)得值作為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的術(shù)前痛閾;第三天進(jìn)行動(dòng)物處理,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的4個(gè)組的動(dòng)物的手術(shù)及痛閾測(cè)定(術(shù)后痛閾)均同時(shí)開(kāi)始進(jìn)行。

　　2.1.2 動(dòng)物處理

　　每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的2組動(dòng)物分別作以下處理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物在同一時(shí)間點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始進(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照組(簡(jiǎn)稱空白組):不造模,于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后與其他各組用同樣的方法、同樣的時(shí)間捆綁固定。動(dòng)物總的固定時(shí)間為30 min.固定結(jié)束后立即測(cè)定痛閾。截肢模型組(簡(jiǎn)稱截肢組):將大鼠固定于自制固定器上,固定10 min后行截肢手術(shù),手術(shù)結(jié)束后繼續(xù)固定動(dòng)物,至總固定時(shí)間滿30 min.固定結(jié)束后立即測(cè)定痛閾,測(cè)定痛閾完畢將動(dòng)物放回籠內(nèi)精心飼養(yǎng)。

　　2.1.3 造模方法

　　參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行:**右后肢皮膚,在踝關(guān)節(jié)下約0.5 mm處截?cái)嘤液笾?縫合皮膚。

　　2.2 痛閾測(cè)定方法

　　篩選動(dòng)物時(shí),基礎(chǔ)痛閾測(cè)定在上午812點(diǎn)進(jìn)行。納入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物,分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)1 h內(nèi)進(jìn)行痛閾測(cè)定。測(cè)定時(shí)均在同一室溫條件下,分別在6個(gè)時(shí)間(08:00、12:00、16:00、20:00、24:00、04:00)對(duì)處理前后的動(dòng)物的痛閾進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定痛閾時(shí)由固定人員測(cè)量動(dòng)物甩尾反應(yīng)潛伏期,所有動(dòng)物均以流水編號(hào)進(jìn)行痛閾測(cè)試。

　　本實(shí)驗(yàn)采用輻射熱甩尾法測(cè)定痛閾,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)試時(shí),所有動(dòng)物按照流水號(hào)測(cè)定一次后,再按照流水號(hào)重復(fù)測(cè)定**次、第三次,保證每只動(dòng)物每次測(cè)試間隔均在10 min以上。取3次測(cè)定的平均值作為*后的痛閾。

　　處理前后2次測(cè)定共得到兩個(gè)痛閾值,分別稱為術(shù)前痛閾和術(shù)后痛閾。以痛閾變化率作為衡量針刺抗創(chuàng)傷痛的效應(yīng)的指標(biāo)之一。痛閾變化率=(術(shù)后痛閾術(shù)前痛閾)/術(shù)后痛閾×100%.創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律實(shí)驗(yàn)研究

　　2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行,另外,所有數(shù)據(jù)還采用Halberg余弦法進(jìn)行生物節(jié)律分析。

　　3 結(jié)果

　　3.1 截肢手術(shù)前后大鼠痛閾的總體變化情況

　　將95只納入實(shí)驗(yàn)的大鼠(馴養(yǎng)過(guò)程中1只大鼠死亡),分別于實(shí)驗(yàn)前、后分6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的痛閾,計(jì)算其痛閾變化率。截肢、電針后,在相應(yīng)時(shí)間立即測(cè)定大鼠痛閾,結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。表1 截肢手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物痛閾變化比較表2 空白對(duì)照組截肢手術(shù)前后24小時(shí)動(dòng)物痛閾節(jié)律變化比較表3 截肢模型組截肢手術(shù)前后24小時(shí)動(dòng)物痛閾節(jié)律變化比較　　　圖1 處理前24小時(shí)周期所有大鼠不同時(shí)間點(diǎn)全部大鼠痛閾變化的折線圖

　　3.2 空白對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)處理前后痛閾的晝夜節(jié)律變化情況

　　對(duì)截肢手術(shù)前后空白對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的痛閾利用Halberg余弦軟件單個(gè)余弦法程序進(jìn)行余弦函數(shù)擬合,并分別計(jì)算其P值(P<0.05表示具有明顯的節(jié)律性)、中值、振幅及峰相位,結(jié)果顯示大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,如表2所示。由于空白對(duì)照組的痛閾變化率沒(méi)有明顯變化,所以不對(duì)其作節(jié)律分析。截肢手術(shù)前24小時(shí)周期全部大鼠痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線見(jiàn)圖2、圖3.創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律實(shí)驗(yàn)研究

　　從以上圖表可以看出,空白對(duì)照組大鼠痛閾在實(shí)驗(yàn)前后的24小時(shí)周期中具有明顯的晝夜節(jié)律,且與實(shí)驗(yàn)前的總體變化節(jié)律接近,均為白天痛閾高,夜間痛閾低,其中16點(diǎn)時(shí)*高,0點(diǎn)(24點(diǎn))4點(diǎn)*低。圖2 截肢手術(shù)前24小時(shí)周期全部大鼠痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖　圖3 空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)動(dòng)物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖

　　3.3 截肢模型組大鼠截肢手術(shù)前后痛閾的晝夜節(jié)律變化情況

　　對(duì)截肢手術(shù)前后截肢模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的痛閾利用Halberg余弦軟件單個(gè)余弦法程序進(jìn)行余弦函數(shù)擬合,結(jié)果見(jiàn)表3及圖4～圖6.創(chuàng)傷痛大鼠手術(shù)前痛閾節(jié)律與空白對(duì)照組類似。截肢模型組大鼠痛閾在實(shí)驗(yàn)前的24小時(shí)周期中具有明顯的晝夜節(jié)律,與實(shí)驗(yàn)前的總體變化節(jié)律接近,均為16點(diǎn)時(shí)*高,0點(diǎn)(24點(diǎn))～4點(diǎn)*低;實(shí)驗(yàn)后的痛閾和痛閾變化率均顯示出一定的晝夜節(jié)律,提示創(chuàng)傷痛大鼠的痛閾仍然具有晝夜節(jié)律,其痛閾變化率也表現(xiàn)出較弱的晝夜節(jié)律(P值為0.049,與0.05接近),說(shuō)明各時(shí)間點(diǎn)痛閾變化并不相同,出現(xiàn)明顯的時(shí)辰差異。圖4 截肢模型組截肢手術(shù)前24小時(shí)動(dòng)物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖圖5 截肢模型組截肢手術(shù)后24小時(shí)動(dòng)物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖圖6 截肢模型組截肢手術(shù)后24小時(shí)動(dòng)物痛閾變化率的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖

　　4 討論

　　早在19世紀(jì),人類就已發(fā)現(xiàn)疼痛反應(yīng)具有晝夜節(jié)律性。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,在不同的時(shí)辰,機(jī)體對(duì)疼痛的反應(yīng)性的高低并不是恒定不變的。機(jī)體的痛閾具有明顯的以24 h為周期的晝夜節(jié)律,如Li G等對(duì)小鼠的痛閾研究顯示,夜間小鼠甩尾潛伏期更長(zhǎng)(痛閾更高),且**受體拮抗劑納洛酮(10 mg/kg,i.p.)可降低痛閾[2];Koch HJ等研究了13例2127歲健康受試者在 6點(diǎn)、12點(diǎn)、18點(diǎn)和24點(diǎn)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)止血帶壓迫所致疼痛的耐受性,研究顯示,24點(diǎn)時(shí)對(duì)壓迫性疼痛的耐受性*高[3]。而且隨著疼痛、鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)和臨床研究的逐漸深入,其對(duì)**功能的影響也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。手術(shù)、創(chuàng)傷等對(duì)機(jī)體造成**功能的抑制已研究很多,這種疼痛及創(chuàng)傷等應(yīng)激所造成的機(jī)體**抑制等效應(yīng),也具有明顯的晝夜節(jié)律特征[4]。時(shí)間生物學(xué)研究表明,人及動(dòng)物對(duì)疼痛的敏感性均存在時(shí)間節(jié)律性,而許多鎮(zhèn)痛**及鎮(zhèn)痛手段的鎮(zhèn)痛效應(yīng)也具有時(shí)間節(jié)律性,如**類鎮(zhèn)痛劑夜間的鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯優(yōu)于白天[5]。我們的研究結(jié)果顯示,正常大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,其峰值在白天12點(diǎn)16點(diǎn),谷值在夜間0點(diǎn)凌晨4點(diǎn)左右,即明期痛閾較高,暗期痛閾較低;創(chuàng)傷痛大鼠痛閾明顯降低,尤其以早晨8點(diǎn)左右痛閾下降明顯,這可為臨床選擇手術(shù)時(shí)機(jī)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。