前 言

    重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTMS)是一種無損傷的物理**方法，目前已逐漸得到人們關(guān)注，在臨床主要用于精神神經(jīng)系統(tǒng)**的**，可以改善神經(jīng)系統(tǒng)退行性**的相關(guān)癥狀，如減輕帕金森病相關(guān)非運(yùn)動(dòng)癥狀，改善抑郁程度，調(diào)節(jié)阿爾茲海默病人的認(rèn)知功能。研究表明，長(zhǎng)期的高頻 rTMS還可以抑制正常老化過程中的認(rèn)知功能降低。研究還指出，rTMS 可以通過多通路，網(wǎng)絡(luò)化的方式來改善個(gè)體的腦組織結(jié)構(gòu)和功能并提高個(gè)體的認(rèn)知功能。

    腦老化是指老化過程中伴隨的腦組織結(jié)構(gòu)和功能的變化。在健康個(gè)體，隨著年齡的增長(zhǎng)，腦老化的進(jìn)程的發(fā)展，健康個(gè)體的認(rèn)知功能也可表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的降低。而且在老化過程中，老化的腦組織也更容易患有神經(jīng)系統(tǒng)退行性**。嚙齒類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯磕X老化及老化相關(guān)的認(rèn)知功能障礙具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如，與人類相似，嚙齒類動(dòng)物的海馬和前額皮層在老化中也是非常容易受損傷的，表現(xiàn)為腦組織結(jié)構(gòu)和功能的變化。已有研究報(bào)道，昆明小鼠在老化過程中可表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的下降，可以作為研究腦老化的理想動(dòng)物模型。在對(duì)嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行認(rèn)知功能的評(píng)估中，被動(dòng)逃避反應(yīng)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的認(rèn)知行為學(xué)檢測(cè)工具。

因此，本部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用昆明小鼠為研究對(duì)象，觀察昆明小鼠在老化過程中的何種程度會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷，并觀察 rTMS 是否可以改善老化引起的認(rèn)知功能障礙。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

磁刺激儀器、被動(dòng)逃避反應(yīng)箱、新物體識(shí)別箱 （購自上海欣軟信息科技有限公司）   

1.2 藥品及試劑

75%酒精 天津市永大化工實(shí)驗(yàn)廠

2 實(shí)驗(yàn)分組及程序

動(dòng)物分組及方法：3-4 月齡昆明小鼠，9-10 月齡昆明小鼠，16-17 月齡昆明小鼠。在實(shí)驗(yàn)室恒溫 20-25 攝氏度飼養(yǎng)，然后用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組，將昆明小鼠為以下 4 組：

（1）老年 rTMS 組：16-17 月齡老年小鼠，磁頭于小鼠的顱頂部每天進(jìn)行 10 組頻率為 25 赫茲的磁刺激，總共刺激脈沖個(gè)數(shù)為 1000 個(gè)，連續(xù)14 天。

（2）老年 sham 組：16-17 月齡老年小鼠，以磁頭反面于小鼠顱頂部進(jìn)行與 rTMS 組相似的無功能的磁刺激。

（3）成年組：9-10 月齡成年小鼠，與老年 sham 組小鼠刺激方式相同。

（4）青年組：3-4 月齡青年小鼠，與老年 sham 組小鼠刺激方式相同。

各組動(dòng)物在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，然后進(jìn)行為期 14 天的 rTMS 或者假刺激，刺激結(jié)束后通過被動(dòng)逃避反應(yīng)箱實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別箱實(shí)驗(yàn)測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力的改變。

3 被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

在連續(xù) 14 天的 rTMS 或 sham 磁刺激后的**天，應(yīng)用被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)昆明小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)試。被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)裝置是一個(gè)不透明塑料箱（箱體為 18 cm × 12 cm × 12 cm），箱內(nèi)靠近一側(cè)箱體放置有一個(gè)絕緣塑料平臺(tái)(直徑 5 cm；高 4.5 cm)。箱底由直徑 0.2 cm 間隔 1 cm 的銅柵構(gòu)成，銅柵可通電。

**天為適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠面對(duì)箱體側(cè)壁放置于平臺(tái)上，任其在箱內(nèi)自由活動(dòng)，適應(yīng)訓(xùn)練時(shí)間 300 s。小鼠會(huì)在放入箱內(nèi)后的一個(gè)很短的時(shí)間內(nèi)跳下窄小，升高的平臺(tái)，記錄這一時(shí)間。實(shí)驗(yàn)的**天進(jìn)行認(rèn)知訓(xùn)練，即在適應(yīng)訓(xùn)練 24 h 后：箱底通電(36 mV)，將小鼠面對(duì)箱體側(cè)壁放在平臺(tái)上，小鼠跳下平臺(tái)即被電擊，返回平臺(tái)，認(rèn)知訓(xùn)練 5 min 后取出小鼠，記錄小鼠跳下平臺(tái)被電擊次數(shù)作為認(rèn)知功能指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)第三天進(jìn)行記憶檢測(cè)，即在認(rèn)知訓(xùn)練 24 h 后：箱底通電，將小鼠面向箱體側(cè)壁放在平臺(tái)上，記錄小鼠**次跳下平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，作為**個(gè)認(rèn)知功能指標(biāo)，如果在 300 s 內(nèi)小鼠都不跳下平臺(tái)，則逃避潛伏期記為 300 s。以電擊次數(shù)和逃避潛伏期反應(yīng)小鼠認(rèn)知功能。

4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

每一只小鼠被單獨(dú)放入一箱體內(nèi)(30×30×30 cm)。箱體內(nèi)放有兩個(gè)不同物體，并間隔 15 厘米。在實(shí)驗(yàn)**天，每只小鼠在箱體內(nèi)自由適應(yīng) 20分鐘。1 小時(shí)后，其中一個(gè)物體被一形狀不同的新物體所替換，將小鼠放入，觀察并記錄 5 分鐘內(nèi)小鼠觸碰兩個(gè)物體的時(shí)間。24 小時(shí)后，另一個(gè)物體被另一個(gè)形狀不同的新物體所替換。觀察并記錄 5 分鐘內(nèi)小鼠觸碰兩個(gè)物體的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中每只小鼠進(jìn)行完一部分實(shí)驗(yàn)后用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)箱消除**氣味對(duì)測(cè)試成績(jī)的干擾。在新物體識(shí)別測(cè)試中反應(yīng)認(rèn)知功能的指標(biāo)被稱為認(rèn)知指數(shù)，即小鼠觸碰新物體的時(shí)間與小鼠觸碰兩個(gè)物體時(shí)間總和的比值。因?yàn)閲X類動(dòng)物具有探索新事物的本性，認(rèn)知指數(shù)的增長(zhǎng)可以反應(yīng)認(rèn)知功能的提高。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SEM）表示。應(yīng)用 one-way ANOVE 統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以 P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)成績(jī)的改變

1.1 老化過程中新物體識(shí)別成績(jī)的下降

在 1 h 時(shí)間點(diǎn)，小鼠觸碰兩物體的總時(shí)間在青年組、成年組和老年組之間沒有明顯差異(Fig. 1A)，在 24 h，小鼠觸碰兩物體的總時(shí)間在三組之間也沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(Fig. 1 B)。在 1 h 時(shí)間點(diǎn)青年組和成年組小鼠之間的認(rèn)知指數(shù)沒有明顯差異，與青年組和中年組相比，老年組小鼠的認(rèn)知指數(shù)顯著降低(Fig. 2)。同樣在 24 h 時(shí)間點(diǎn)，與青年和中年組相比，老年組小鼠的認(rèn)知指數(shù)顯著降低，而青年組和中年組小鼠之間沒有顯著差異。1.2 rTMS 顯著改善了老年小鼠的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的成績(jī)。

在 1 h 時(shí)間點(diǎn)，小鼠觸碰兩物體的總時(shí)間在老年組和老年 rTMS 組沒有明顯差異(Fig. 1A)，同樣在 24 h，小鼠觸碰兩物體的總時(shí)間在兩組之間也沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(Fig. 1 B)。在 1 h 時(shí)間點(diǎn)老年組和老年 rTMS 組小鼠之間的認(rèn)知指數(shù)沒有明顯差異，與老年組相比，老年 rTMS 組小鼠的認(rèn)知指數(shù)顯著提高(Fig. 2)。同樣在 24 h 時(shí)間點(diǎn)，與老年組相比，老年 rTMS組小鼠的認(rèn)知指數(shù)顯著提高。

2 被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)成績(jī)

2.1 老化過程中被動(dòng)逃避反應(yīng)成績(jī)的改變

被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段的潛伏期在青年組、成年組和老年組之間沒有顯著差異(Fig. 3)。與青年組和中年組相比，學(xué)習(xí)階段的電擊次數(shù)在老年組昆明小鼠明顯增多(Fig. 4)，而青年組和成年組小鼠學(xué)習(xí)階段的電擊次數(shù)無顯著差異。與青年鼠和成年鼠相比，記憶階段的被動(dòng)逃避潛伏期在老年組小鼠顯著縮短，同樣青年組和成年組之間記憶階段的被動(dòng)逃避潛伏期沒有顯著差異(Fig. 5)。上述結(jié)果表明，昆明小鼠的認(rèn)知功能在 16 月齡時(shí)出現(xiàn)了損傷。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善老化引起的認(rèn)知功能障礙

2.2 rTMS 顯著提高了老化過程中被動(dòng)逃避反應(yīng)成績(jī)

被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段的潛伏期在老年組和老年 rTMS 組小鼠之間沒有顯著差異(Fig. 3)。與老年組相比，學(xué)習(xí)階段的電擊次數(shù)在老年rTMS 組昆明小鼠顯著減少(Fig. 4)。同樣與老年組小鼠相比，記憶階段的被動(dòng)逃避潛伏期在老年 rTMS 組小鼠出顯著增長(zhǎng)(Fig. 5)。上述結(jié)果表明，rTMS 可以改善昆明鼠在老化過程中出現(xiàn)的認(rèn)知功能損傷。

討 論

腦老化過程中伴隨著腦組織結(jié)構(gòu)和功能的改變，老年個(gè)體并表現(xiàn)出認(rèn)知功能的下降。前額皮層和海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵**，是在年齡增長(zhǎng)過程中也是*易受損傷的腦區(qū)。因此，與此部分腦區(qū)相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力也會(huì)伴隨著年齡的增長(zhǎng)而出現(xiàn)損傷。嚙齒類動(dòng)物因其應(yīng)用廣泛，是對(duì)認(rèn)知功能進(jìn)行研究的良好的動(dòng)物模型，可用于探討認(rèn)知功能改變的內(nèi)置分子生物學(xué)機(jī)制。與人類相似，嚙齒類動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力在老化過程中出現(xiàn)了下降，并且伴隨著前額皮層和海馬相關(guān)腦區(qū)的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

因此，應(yīng)用嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究老化過程認(rèn)知功能受損的具體機(jī)制具有非常重要的意義。嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的變化可以應(yīng)用行為學(xué)測(cè)試方法進(jìn)行檢測(cè)。被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物認(rèn)知功能的經(jīng)典認(rèn)知行為學(xué)測(cè)試方法并可檢測(cè)與額皮層和海馬區(qū)密切相關(guān)的認(rèn)知功能。昆明小鼠是我國(guó)*常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，具有可操作性強(qiáng)、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠進(jìn)行的研究，觀察小鼠在老化過程中認(rèn)知功能的變化，我們的研究結(jié)果與已有的研究報(bào)道相似，昆明小鼠在老化過程中出現(xiàn)了增齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙。在本課題中我們分別應(yīng)用了跳臺(tái)被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)方法從動(dòng)物的被動(dòng)學(xué)習(xí)能力，新異物體識(shí)別方法對(duì)動(dòng)物的天性偏愛記憶進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)老化過程中昆明小鼠的被動(dòng)和主動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力都受到了損傷。我們首先證明了昆明鼠在 9 月齡時(shí)的認(rèn)知功能沒有發(fā)生變化，而小鼠的認(rèn)知功能的減低出現(xiàn)在 16 月齡。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善老化引起的認(rèn)知功能障礙

rTMS 是一種**、非侵入性的物理**方法。目前在臨床得到廣泛應(yīng)用，在神經(jīng)精神系統(tǒng)**的預(yù)防和**中具有良好的效果。在神經(jīng)系統(tǒng)退行性**的**中的應(yīng)用也逐步得到人們重視。研究表明 rTMS 可以改善正常老化過程中的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能降低。rTMS 可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性，改善長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）現(xiàn)象。研究報(bào)道應(yīng)用高頻的 rTMS 在改善動(dòng)物 LTP 的同時(shí)可以提高其新物體識(shí)別的成績(jī)。在我們的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，rTMS 可以改善老化過程中昆明小鼠的被動(dòng)逃避反應(yīng)成績(jī)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)成績(jī)。為進(jìn)一步探討 rTMS 改善正常老化過程中認(rèn)知功能損傷的深入機(jī)制選擇了一種較為理想的動(dòng)物模型。

小 結(jié)

昆明小鼠的認(rèn)知功能在青年組和成年組沒有出現(xiàn)明顯差異，而在 16月齡時(shí)開始出現(xiàn)下降，而應(yīng)用 rTMS 可以改善老化引起的認(rèn)知功能損傷。