1 對(duì)象和方法
1 . 1 對(duì)象 21 日齡雄性 SD 大鼠 30 只 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) ,體質(zhì)量為 ( 50 ± 5) g ;按隨機(jī)數(shù)字法均分為果糖干預(yù)組 ( FD P intervention gro up , FD) 、 鹽水對(duì)照組( so dium chloride solution control , NS) 和熱性驚厥組 ( FS) ,每組大鼠數(shù)目均為 10 只 ;各組均于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng) ,自由進(jìn)食飲水 。
1 . 2 方法
1 . 2 . 1 模型建立 采用改良熱水浴法建立熱性驚厥大鼠模型 。FD 組大鼠每次誘發(fā)熱性驚厥前 30 mi n , 按 25 mg/10 0 g ( 即1 ml / 1 0 0 g ) 大鼠體重的劑量向大鼠腹腔內(nèi)注射2 . 5 %的 FD P 溶液 ( FD P 由海南天王國(guó)際制藥有限公司提供 ,批號(hào) : 20050114) ;而 N S 組大鼠腹腔注射相同體積 ( 1 ml/100 g 大鼠體重) 的 0 . 9 %氯化鈉溶液 ; FS 組不給予任何干預(yù)措施 。
1 . 2 . 2 避暗試驗(yàn) (pa s sive avoi da nce t e st , PA T) SF K-Ⅰ 型避暗測(cè)試箱 (日本產(chǎn)) 分明 、 暗兩室 ,其間有小門相通 ; 避暗習(xí)性使大鼠本能地選擇進(jìn)入暗室 ,進(jìn)入暗室的大鼠即刻遭受電擊 ( 3 mA ,50 Hz) 而被動(dòng)地逃回**的明室 。5 mi n 不進(jìn)入暗室則被認(rèn)為完成了學(xué)習(xí) ,記錄大鼠在完成學(xué)習(xí)前錯(cuò)誤地進(jìn)入暗室的次數(shù) ,主要反映大鼠近期學(xué)習(xí)的能力 ; 24 h 后再次放回明室 ,記錄大鼠由明室進(jìn)入暗室的時(shí)間 , 即為記憶潛伏期 ,主要反映大鼠近期記憶的能力 。
1 . 2 . 3 曠場(chǎng)試驗(yàn) (op e n f iel d t e st , O F T) 60 cm × 60 cm ×60 cm 的無頂木盒底部等分為 36 個(gè)小方格 , 大鼠放置于中央方格 ,記錄 5 mi n 內(nèi)大鼠活動(dòng)經(jīng)過的格子數(shù) 、 后肢性站立的次數(shù)以及排出糞便的粒數(shù) 。 記分標(biāo)準(zhǔn)為 :大鼠 1/ 2 以上身
體進(jìn)入相鄰方格記 1 分 ,后肢性站立記 1 分 ,合計(jì)為其總分 。研究認(rèn)為 ,經(jīng)過的格子數(shù)反映動(dòng)物的興奮性 ; 后肢性站立的次數(shù)代表大鼠對(duì)陌生環(huán)境的適應(yīng)能力 ;排出糞便的粒數(shù)提示大鼠的緊張程度。
1 . 2 . 4 Mo r ri s 水迷宮 ( Mo r ri s wat e r maze , MWM) 試驗(yàn)
Mo r ri s 水迷宮由圓形水池 ( 直徑 160 cm ,高 50 cm) 、 攝像頭以及操作分析系統(tǒng)組成 。 圓形水面被通過圓心的兩條假想垂線劃分為 4 個(gè)象限 。 試驗(yàn)前**使大鼠在水池內(nèi)自由游泳 2 mi n ,以熟悉環(huán)境 。 試驗(yàn)共 4 . 5 d ,在一個(gè)象限的正中水域內(nèi)放置一個(gè)圓形透明站臺(tái) (直徑 10 cm ,高 28 cm) ,站臺(tái)隱于水面下 2 cm 處 , 水溫保持于 24 ℃ 左右 。每天上 、 下午各進(jìn)行 4 次試驗(yàn) ,每只大鼠隨機(jī)從每個(gè)象限的中點(diǎn)面壁式入水1 次 ,大鼠入水后盡力逃避水患 ,當(dāng)發(fā)現(xiàn)站臺(tái)后則棲身其上 ,SuperMaze圖象采集系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠找到站臺(tái)的潛伏期 。如果 120秒仍未找到站臺(tái) ,由操作者將大鼠引上站臺(tái)休息 4 秒并將潛伏期記為 120 秒 。 每只大鼠上 、 下午 4 次成績(jī)的均值作為一個(gè)時(shí)段值 ( Ⅰ-Ⅸ ) 進(jìn)行分析 。 大鼠搜尋站臺(tái)的策略分為直線式 、 趨向式 、 隨機(jī)式和邊緣式。 從搜尋站臺(tái)的效率來看 ,四種策略的優(yōu)劣次序依次為直線式 、 趨向式 、 隨機(jī)式 、 邊緣式 。
1 . 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 ( Š x ± s) 表示 。采用 SPSS 10 . 0 統(tǒng)計(jì)軟件依資料性質(zhì)分別進(jìn)行方差分析及q 檢驗(yàn) 、 χ2檢驗(yàn) , MWM 試驗(yàn)應(yīng)用自帶軟件進(jìn)行方差分析 ,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α= 0 . 05 。
2 結(jié) 果
2 . 1 PA T 中學(xué)習(xí)記憶的變化 FD 組大鼠在達(dá)到學(xué)會(huì)程度時(shí)錯(cuò)誤次數(shù)*少 , 同 N S、 FS 組有顯著性水迷宮及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠情感行為的影響機(jī)制異 ( q = 6 . 63 , 6 .29 ; P < 0 . 01 ) 。24 h 后 FD 組大鼠的記憶潛伏期*長(zhǎng) , 同N S、 FS 組差異有顯性 ( q = 5 . 76 , 6 . 03 ; P < 0 . 01 ) 。表明FD P 對(duì)反復(fù)熱性驚厥導(dǎo)致的近期學(xué)習(xí)記憶受損有保護(hù)作用 。
2 . 2 O F T 中情感行為的改變 FD 組大鼠穿格得分分值*高 ,后肢性站立的次數(shù)*多 , 5 mi n 內(nèi)排出的糞便粒數(shù)*少 ;FD 組同 NS 、 FS 組在穿格得分 ( q = 4 . 89 ,4 . 63 ; P < 0 . 01) 、 后肢性站立的次數(shù) ( q = 5 . 38 ,5 . 07 ; P < 0 . 01) 以及排出糞便粒
數(shù) ( q = 5 . 81 ,5 . 64 ; P < 0 . 01) 等方面的差異有顯著性 , 提示FD P 可以改善反復(fù)驚厥導(dǎo)致的大鼠情感行為異常 ?！ ?/font>
2 . 3 MWM 試驗(yàn)中空間學(xué)習(xí)能力的變化 FD 組大鼠在Mo r ri s 水迷宮中尋找隱匿站臺(tái)的能力提高 ,表現(xiàn)為逃逸潛伏期顯著縮短 ,方差分析表明 FD 組同 N S、 FS 組在逃逸潛伏期方面存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 ( F = 133 . 19 , P < 0 . 01) 。
3 討 論
多項(xiàng)長(zhǎng)期隨訪研究發(fā)現(xiàn) FS 和日后情感行為異常 、 學(xué)習(xí)困難 、 智能發(fā)育落后以及顳葉癲癇等有一定的聯(lián)系。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)反復(fù) FS 可導(dǎo)致未成熟腦的功能( 學(xué)習(xí)記憶和情感行為) 和形態(tài)結(jié)構(gòu)( 神經(jīng)元 、 細(xì)胞器) 出現(xiàn)不同程度損傷 。FS 腦損傷干預(yù)措施的研究已受到關(guān)注 。 本實(shí)驗(yàn)預(yù)注射FD P 對(duì)反復(fù)熱性驚厥的幼鼠進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn) , FD P 改善了反復(fù)驚厥大鼠的學(xué)習(xí)記憶和情感行為 ,提示 FD P 對(duì) FS 腦功能損傷具有保護(hù)作用 。
3 . 1 FD P 的臨床應(yīng)用與作用機(jī)制 FD P 是葡萄糖代謝中的一種重要的中間產(chǎn)物 ,可激活糖酵解中限速酶 - 磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶活性 ,加速磷酸烯酮式丙酮酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化 ,增加細(xì)胞內(nèi)能量 , FD P 與細(xì)胞膜相互作用改變膜離子通透性 ,能有效防止平滑肌細(xì)胞 、 神經(jīng)元 、 血小板 、 神經(jīng)細(xì)胞 、 心肌細(xì)胞的 “ 鈣超載” , 提高激活 Na+2 K+泵的活性 , 防止細(xì)胞水腫,具有膜穩(wěn)定 、 細(xì)胞保護(hù) 、 抗氧化及改善氧代謝等作用 。FD P 在臨床上已廣泛應(yīng)用于心肌受損性**輔助** ,此外還應(yīng)用 于 肝 、 腎 、 腦 血 管 等疾 病 治 療 和 研 究。FD P 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制主要有: ① FD P 作為一種高能物質(zhì)及糖酵解的調(diào)節(jié)劑 ,參與細(xì)胞代謝提高腦組織無氧代謝的 A TP 生成量 ; ② 提高離子泵能量 ,抑制 Ca2 +內(nèi)流 ,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Ca2 +,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 ; ③ 促進(jìn)糖無氧酵解 , 抑制有
氧氧化 ,從而減少氧自由基和有害氨基酸的產(chǎn)生 ; ④ 提高紅細(xì)胞內(nèi) 2 ,3 2 二磷酸甘油酸含量 ,穩(wěn)定紅細(xì)胞膜 , 增加缺氧組織對(duì)氧的利用 。此外 , FDP 減少缺氧后大腦早期基因蛋白mRNA 的表達(dá) ,抑制凋亡和神經(jīng)元壞死; FD P 還具有改善和調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)通路的作用 。
3 . 2 FD P 對(duì)驚厥性腦損傷的保護(hù)作用 反復(fù)多次熱性驚厥發(fā)生時(shí) ,大腦處于缺氧及相對(duì)性缺血狀態(tài) , 對(duì)缺氧缺血敏感的海馬部位表現(xiàn)更為明顯 。頻繁驚厥所致的缺氧可使線水迷宮及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠情感行為的影響機(jī)制
粒體發(fā)生病理變化 ,出現(xiàn)腫脹甚至空泡樣變 ,細(xì)胞產(chǎn)生 A TP不足 ,致使維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡的各種通道功能受損 , 尤其是 A TP 依賴性的 Ca2 +通道受累 , Ca2 +外流作用受阻而出現(xiàn)反向內(nèi)流 , Ca2 +內(nèi)流造成的鈣負(fù)載以及由此而激發(fā)的各種興奮性氨基酸及自由基的大量釋放 ,*終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死 ;興奮性神經(jīng)遞質(zhì)應(yīng)激狀態(tài)下的大量釋放以及缺氧狀態(tài)下神經(jīng)突觸聯(lián)系功能的減弱 ,使神經(jīng)元異常興奮放電增強(qiáng) , 又可以促發(fā)驚厥的發(fā)生 , 形成惡性循環(huán)。FD P 是重要的能源物質(zhì) ,可以通過各種生物膜和血腦屏障而到達(dá)**神經(jīng)系
統(tǒng)的組織和細(xì)胞 ,提供離子泵活動(dòng)以及神經(jīng)元代謝所需的能量 ,保證正常狀態(tài)下 Ca2 +的外流 , 阻止 Ca2 +反向內(nèi)流 ; 促進(jìn)攜氧紅細(xì)胞在缺氧組織釋放氧 ,增加缺氧局部的氧含量 , 緩解細(xì)胞缺氧狀態(tài) ;增強(qiáng)紅細(xì)胞內(nèi)二磷酸甘油酸含量 , 抑制氧自由基和組織胺釋放的作用 。推測(cè)以上機(jī)制的綜合參與使驚厥性神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕 ,學(xué)習(xí)記憶等腦功能改善 。
熱性驚厥 (febrile seizure s , FS) 是兒科常見急癥 ,有導(dǎo)致不同程度腦損傷的潛在危險(xiǎn) 。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)反復(fù)熱性驚厥可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能異常和神經(jīng)元 、 細(xì)胞器及突觸病理結(jié)構(gòu)變化。 作者采用腹腔預(yù)注射 1 ,6 - 二磷酸果糖 (f r uc-to se - 1 ,6 -dip ho sp hate , FDP) 對(duì)反復(fù)熱性驚厥的幼鼠進(jìn)行干預(yù) ,探討 FDP 對(duì)大鼠熱性驚厥性學(xué)習(xí)記憶和情感行為損害是否具有保護(hù)作用 。
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