摘要

目的:比較5-經(jīng)色胺神經(jīng)元損毀致小鼠抑郁癥狀模型與慢性刺激抑郁模型小鼠強制游泳實驗和懸尾實驗中的行為學特點，評估兩種模型在研究抑郁癥中的適用性。

方法:實驗于2005-04/07在解放軍第四軍醫(yī)大學完成。①分組:40只C57BU6小鼠隨機分為慢性刺激組、5-經(jīng)色胺損毀組、假手術組及空白對照組。②模型制備:慢性刺激組小鼠每日慢***刺激，共21  d;5-9色胺損毀組小鼠腦室中注射特異性5-9色胺毒劑5,7一雙經(jīng)色胺，特異性損毀小鼠中縫背核中的5-f}色胺能神經(jīng)元;假手術組小鼠側(cè)腦室給予注射等量的生理鹽水。③觀察指標:分別測試兩種模型小鼠的體質(zhì)量變化、蔗糖攝取實驗、強制游泳實驗和懸尾實驗等行為學表現(xiàn)。

結(jié)果:40只小鼠均進人結(jié)果分析。5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組的小鼠表現(xiàn)出多項抑郁癥狀:①兩者模型小鼠體質(zhì)量增加緩慢、增加量明顯減少。②兩種模型小鼠均表現(xiàn)糖攝取量明顯減少。③兩種模型小鼠強制游泳實驗和懸尾實驗中無動時間的總和均明顯延長。

結(jié)論:慢性刺激模型和5-經(jīng)色胺損毀模型均復制出人類了抑郁癥的多項表現(xiàn)，提示環(huán)境因素的改變和5-經(jīng)色胺降低在抑郁癥的發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。強迫游泳與懸尾實驗兩種抑郁模型的行為學比較

主題詞:抑郁癥;5-經(jīng)色胺:慢性刺激

1材料和方法

    設計:隨機對照動物實驗。

    單位:解放軍第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院康復與理療科。

    材料:實驗于2005-04/07在解放軍第四軍醫(yī)大學完成。40只C57BL/6小鼠，鼠齡10周，體質(zhì)量2021  g，無特殊病原體，第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心提供。置于安靜、溫暖、晝夜明暗周期為8:00-20:00光照、20:00一次日8:00黑暗的實驗室中，自由飲水、攝食。飼養(yǎng)1周后，隨機分為慢性刺激組、5-輕色胺損毀組、假手術組及空白對照組，每組10只。

    設計、實施、評估者:實驗設計為**作者，在日本大阪大學經(jīng)過行為學評估培訓;實施及評估為全部作者，動物分組及編號由**、三、四作者進行，評估采用盲法。

    方法:

    動物模型制備:①慢性刺激模型:每日給予小鼠刺激[9，小鼠單獨飼養(yǎng)，每天隨機暴露于以下刺激中的一種，共持續(xù)21d:干鋸屑墊料、置于空籠、籠子傾斜  (45℃)、播放掠食者錄音、晝夜顛倒、冷水游泳。在蔗糖攝取實驗前**不給予任何刺激。25-9色胺損毀模型:5-經(jīng)色胺損毀組和假手術組手術前腹腔注射去甲丙咪嗓(25  mg/kg)和諾米芬辛(10  mg/kg),  40  min后給予****鈉(65  mg/kg)腹腔麻醉后，將動物固定在立體定位儀。按照以下位置(與前自距離):向后一0.7  mm，旁開1.0  mm，深度一1.7  mm，用10  [LL漢密頓微量注射器進行雙側(cè)腦室注射。5-輕色胺損毀組經(jīng)腦室注射5,7一雙經(jīng)色胺(Sigma,  USA)  50  jig,溶解于含1  g/L檸檬酸的生理鹽水)) o假手術組注射等量的含1  g/L檸檬酸的生理鹽水。注射后留針5  min,③空白對照組:不接受注射或刺激，群體飼養(yǎng)。各組每天經(jīng)同一人

輕柔抓取動物5  min,

    體質(zhì)量測定:每兩日稱量一次小鼠體質(zhì)量，直至21  d，將體質(zhì)量增長繪制曲線，另外計算各組第21天與實驗前比較體質(zhì)量增加的數(shù)值，進行統(tǒng)計分析。強迫游泳與懸尾實驗兩種抑郁模型的行為學比較

    蔗糖攝取實驗:在造模前和造模后21d，分別計算小鼠在1h內(nèi)飲用10  g/L蔗糖溶液量，以此乒映小鼠的獎賞反應程度。在實驗前14h內(nèi)，停止攝取食物和水。

    懸尾實驗:儀器型號XR-XX203,廠家：上海欣軟，動物尾部遠端1.5  cm處固定后懸掛于40  cmx40  cmx40  cm的白色樹脂玻璃盒中，距地面15  em。無肢體掙扎運動記為不動，記錄6  min內(nèi)的第2-6分鐘的不動時間總和，此成績反應動物的無助程度。

    強迫游泳實驗:參考Porsolt強制游泳實驗121，儀器型號XR-XQ202,廠家：上海欣軟，將動物放人直徑為25  cm，高度為40  cm的透明樹脂玻璃水缸，水深15  cm，水溫25℃，動物除了保持漂浮所需的必要的*小運動外肢體停止運動記為不動，記錄6  min內(nèi)的第2-6分鐘的不動時間總和，此成績反應

動物的無助程度。

    **組織化學染色:動物存活21d后，由過量****鈉(70  mg/kg)麻醉后，用15  mL  0.01  mol/L磷酸鹽緩沖液和50  mL  40  g/L多聚甲醛灌注固定后，立即取腦置于200  g/L蔗糖溶液，4℃過夜沉底后，取全腦進行冰凍切片(Cry ostal;  Leitz,Wetzal,Germany)，片厚30  Rm,隔五取一收集于0.01  mol/L磷酸鹽緩沖液中。

    切片經(jīng)封閉液(磷酸鹽緩沖液，含10  g/L  Bovineserum,  50酬L  NGS,  3歲L  Triton  X-100)  30  min，后分別浸人一抗:兔抗酪氨酸經(jīng)化酶抗體沙500,CHEMICON Intern ational  Inc);兔抗5-輕色胺抗體(1:5  000,  Sigma);  4℃孵育24  h,PBST洗滌3次后人鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(1:1  000'Sigm司4  9C孵育24  h,經(jīng)PBST洗滌3次后浸人混合熒光二抗Alexa  546goat  anti  rabbit  IgG (1:1  000,  Molecular  probes)和Alexa538  goat  anti  mouse  IgG (1:1  000,  Molecular  probes)中，室溫避光孵育3h，隨后PBST洗滌后封固，在激光共聚焦熒光顯微鏡(Carl  Zeiss  Microlmaging,  Inc.)下觀察并采圖。

    主要觀察指標:①小鼠造模前和造模后不同時間的體質(zhì)量改變及蔗糖攝取、強制游泳實驗和懸尾實驗等抑郁相關行為學測定。②小鼠中縫背核5-9色胺神經(jīng)元的改變。

統(tǒng)計學分析:各組數(shù)據(jù)以x1:表示，由**作者利用SPSS  11.0軟件進行單因素方差分析，組間差異采用Dunnett  '  s后檢驗，a=0.05作為檢驗水準。強迫游泳與懸尾實驗兩種抑郁模型的行為學比較

2結(jié)果

2.1實驗動物數(shù)量分析實驗中參加實驗小鼠40只，無中途脫落，進人結(jié)果分析小鼠40只。

2.2各組小鼠體質(zhì)量變化見圖1。在動物造模前，各組動物的體質(zhì)量沒有顯著差別，隨著時間延長，各組小鼠的體質(zhì)量均表現(xiàn)出逐漸增加。其中，假手術組和空白對照組小鼠的體質(zhì)量增加明顯，約增加了4g，而5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組的小鼠體質(zhì)量增加緩慢，增加量也明顯比假手術組和空白對照組小鼠少。

2.3各組小鼠蔗糖攝取實驗結(jié)果見圖2，在空白對照組和假手術組小鼠的1h內(nèi)的蔗糖溶液攝取量幾乎完全一樣，而5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組小鼠的蔗糖溶液攝取量明顯減少(P  <  0.01)，尤其是5-經(jīng)色胺損毀組。

2.4各組小鼠強制游泳實驗和懸尾實驗結(jié)果 見圖3，在懸尾實驗和強制游泳實驗中，空白對照組和假手術組小鼠的“無動時間”無差別，5-經(jīng)色胺損毀組和慢性刺激組小鼠在兩個實驗中的無動時間均明顯延長伊<0.01)，其中5-經(jīng)色胺損毀組在強制游泳實驗中無動時間的延長更顯著，而慢性刺激組在懸尾實驗中的無動時間的延長更顯著。

3討論

    抑郁癥的動物模型根據(jù)誘發(fā)抑郁的方式不同，可以分為**誘發(fā)和環(huán)境因素改變誘發(fā)兩大類模型。慢性應激抑郁模型具有高度的有效性，并可持續(xù)幾個月，基本符合抑郁模型的要求，在目前國外文獻中廣泛使用[3.410鼠類偏愛于甜的溶液，慢性應激經(jīng)常減少蔗糖的攝取。這種糖偏好的減少被解釋為快感缺乏，這是抑郁癥診斷的一個核心癥狀閻，強制游泳實驗和懸尾實驗是*常用的兩個用于致抑郁劑和抗抑郁劑研究的實驗回。小鼠在水中放棄游泳掙扎和在懸吊于半空中時放棄掙扎的狀態(tài)的時間總和稱為無動時間，反應了小鼠“無助”的癥狀。在本實驗中所使用的慢性應激模型導致小鼠體質(zhì)量減輕、蔗糖攝取減少及明顯的懸尾實驗和強制游泳實驗中無動時間的延長，表現(xiàn)出抑郁樣癥狀。

    本實驗中的另一個模型一5-經(jīng)色胺損毀組，在本實驗中所使用劑量的5,7一雙經(jīng)色胺經(jīng)側(cè)腦室注射后21  d，接近100%地損毀了中縫背核中的5-經(jīng)色胺能神經(jīng)元，在中縫背核中只剩下少量不規(guī)則纖維。其他的實驗中顯示中縫背核中5-經(jīng)色胺神經(jīng)元消失，而被星型膠質(zhì)細胞所充填。近年來的研究認為膠質(zhì)細胞在抑郁癥的發(fā)病和**中也承擔重要角色，但是其具體作用目前尚在研究之中。

    在21  d的生存時間中，5-經(jīng)色胺損毀組小鼠體質(zhì)量增加明顯緩于另外兩個對照組。在蔗糖攝取實驗中，表現(xiàn)出蔗糖攝取的明顯減少，表明對獎賞的反應下降。當然不能完全排除由于體質(zhì)量增加減慢帶來的攝取量的減少。而在強制游泳實驗和懸尾實驗中，“無動時間”的延長反映其“無助”的表現(xiàn)。本實驗中小鼠模型在體質(zhì)量改變、蔗糖攝取實驗、懸尾實驗和強制游泳實驗中均表現(xiàn)出與慢性應激模型類似的行為學表現(xiàn)。

    大量研究發(fā)現(xiàn)5-PI-色胺缺乏與抑郁心境、食欲減退、**、晝夜節(jié)律紊亂、***功能紊亂、性功能障礙、不能應付應激、活動減少等癥狀有關。54Ar色胺活動的不足，是引起抑郁的高危因子;其依據(jù)包括:① 5-經(jīng)色胺能活動的**經(jīng)常導致一些抑郁的癥狀:情緒，食欲，活動，性，認知障礙及**。②在志愿者研究發(fā)現(xiàn)干擾5-9色胺的合成或儲存可以引起抑郁門，尤其是有抑郁癥家族史的志愿者[81。而抑郁癥患者**后，如果耗竭色氨酸，會增加在12個月中復發(fā)率[[ 91。對于用5-輕色胺特效的抗抑郁****后的患者，耗竭5-經(jīng)

色胺而保留去甲腎上腺素也會引起復發(fā)[1 101,③抑郁患者出現(xiàn)5-經(jīng)色胺活動的異常，包括5-輕色胺前體一L-色胺酸減少，5-經(jīng)色胺合成，釋放，重攝取及代謝的障礙，以及其突觸后受體的異常。④抗抑郁**，尤其是SSRI，往往是通過提高5-輕色胺含量而發(fā)揮作用?，F(xiàn)

有的一些體內(nèi)外實驗也支持抑郁患者確實存在5-經(jīng)色胺功能障礙，例如抑郁患者血漿色氨酸水平低、腦脊液5-經(jīng)色胺代謝物也低，**者額葉皮質(zhì)中5-色胺受體密度增高，都說明抑郁癥與5-經(jīng)色胺關系密切。強迫游泳與懸尾實驗兩種抑郁模型的行為學比較

    本實驗中兩種模型表現(xiàn)出相似的行為學改變，都復制出部分抑郁癥狀。很多實驗結(jié)果顯示持續(xù)應激可以引起5-經(jīng)色胺和促腎上腺皮質(zhì)素釋放**一皮質(zhì)醇系統(tǒng)的改變口’]。但是在5-經(jīng)色胺損毀組中的小鼠其體質(zhì)量改變、蔗糖攝取實驗、懸尾實驗和強制游泳實驗中的無動時間的變化比慢性應激小組的變化更顯著。提示慢性應激引起抑郁的機制可能不止涉及5-色胺系統(tǒng)。而5-經(jīng)色胺的減少的作用主要是導致抑郁癥狀，還存在抑制抑郁癥狀發(fā)生的其他因素。本實驗結(jié)果也提示后一模型可以模擬出抑郁癥的某些癥狀，本實驗室正在應用此模型進一步研究5-輕色胺含量的減少在抑郁癥發(fā)生中的作用。