大鼠腦創(chuàng)傷后p53、Bax和Fas蛋白的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

摘  要

　　　目的：在分子生物學(xué)水平，進(jìn)一步深入研究顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡的機(jī)制，探討美洛寧對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后學(xué)習(xí)記憶功能的影響，為臨床**顱腦創(chuàng)傷病人提供一定的理論基礎(chǔ)。大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　　材料與方法：1、采用Marmarou 1994年創(chuàng)立的方法建立大鼠重型閉合性顱腦創(chuàng)傷模型。2、將Wistar大鼠300只隨機(jī)分為腦創(chuàng)傷組（96只）、美洛寧**組（96只）、假手術(shù)組（96只），每組又分別劃分成傷后3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、168小時(shí)及336小時(shí)等8個(gè)時(shí)相組，另取12只作為正常對(duì)照組。3、給**法：美洛寧**組經(jīng)致傷后，給予腹腔注射美洛寧（30mg/kg/天），直至各時(shí)相點(diǎn)處死；腦創(chuàng)傷組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組在相同時(shí)間給予等量的生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照。4、另取48只大鼠隨機(jī)分為腦創(chuàng)傷組（12只）、美洛寧**組（12只）、假手術(shù)組（12只）及正常對(duì)照組（12只），進(jìn)行水迷宮測(cè)試。5、采用HE染色、**組織化學(xué)、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)及Morris水迷宮等方法，動(dòng)態(tài)觀察大鼠顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)的組織病理改變，p53、Bax和Fas蛋白的表達(dá)情況以及空間學(xué)習(xí)記憶的改變。6、通過(guò)比較傷后各組相同時(shí)相點(diǎn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、p53、Bax和Fas蛋白表達(dá)以及學(xué)習(xí)記憶功能的變化特征，探討美洛寧對(duì)大鼠傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響。
　　　結(jié)果：1、重型閉合性顱腦創(chuàng)傷后海馬CA2-3區(qū)于傷后72小時(shí)可觀察到廣泛的神經(jīng)元變性、壞死。，隨后該病理趨勢(shì)逐漸減緩。2、凋亡陽(yáng)性細(xì)胞在傷后24小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量逐漸增多，傷后7天達(dá)高峰隨后數(shù)量開(kāi)始下降。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞主要位于海馬CA2-3區(qū)及齒狀回。假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組海馬CA2-3區(qū)未檢測(cè)出凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。3、大鼠傷后3小時(shí)海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)P53蛋白表達(dá)。12小時(shí)明顯增強(qiáng)，1-2天達(dá)高峰，3天即有所下降，于傷后7天已不能檢測(cè)到p53蛋白的**反應(yīng)，鏡下觀察可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞著棕黃色。。假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組海馬CA2-3區(qū)未檢測(cè)出p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。4、大鼠傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應(yīng)增強(qiáng)，于2-3天達(dá)高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復(fù)至正常水平。正常對(duì)照組CA2-3區(qū)可見(jiàn)輕度的Bax蛋白的**反應(yīng)，假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)均與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。5、大鼠傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達(dá)增加，于12小時(shí)明顯增強(qiáng)，2-3天達(dá)高峰，7天明顯下降，于14天Fas蛋白**反應(yīng)消失。假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組海馬CA2-3區(qū)未檢測(cè)到Fas蛋白的表達(dá)。6、美洛寧**組傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞P53、Bax及Fas蛋白表達(dá)高峰均較創(chuàng)傷組明顯下調(diào)。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞密度亦較創(chuàng)傷組有所下調(diào)。7、Morris水迷宮測(cè)試表明，傷后大鼠存在明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，于傷后9天及10天潛伏期明顯延長(zhǎng)，搜索運(yùn)動(dòng)軌跡顯示：美洛寧**組、正常對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠隨時(shí)間在搜索策略的改變上較腦創(chuàng)傷組更為理想。大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　　　結(jié)論：1、重型閉合性顱腦創(chuàng)傷后，海馬區(qū)神經(jīng)元存在有延遲性細(xì)胞死亡現(xiàn)象其形式不僅表現(xiàn)有壞死，也表現(xiàn)有細(xì)胞的凋亡。2、海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的延遲性死亡是造成大鼠傷后長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙的主要因素之一。3、p53、Bax及Fas蛋白的表達(dá)上調(diào)可能參與調(diào)控了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。4、美洛寧可能通過(guò)抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。5、美洛寧可能通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)及重塑信息環(huán)路對(duì)傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙發(fā)揮**作用。
　　　
　　　關(guān)鍵詞：重型閉合性顱腦損傷  海馬  神經(jīng)元  凋亡  p53  Bax  Fas  學(xué)習(xí)  記憶  Morris水迷宮  美洛寧
　　　
Experimental Research on the Effect of the  Expression of p53, Bax and Fas Proteins and  Neuronal Apoptosis on Cognitive function after Traumatic Brain Injury in Rats。
Abstract
        Objective: On the level of molecular biology, certain theoretical bases are provided for clinical therapy on the basis of deeply studying mechanism of delayed neuronal death after traumatic brain injury and probing into the influences of cognitive functions of CTP on rats after brain trauma.
　　　Materials and Methods: 1. The model of severe closed traumatic brain injury(TBI) was established according to the method created by Marmarou in 1994. 2. 300 Wistar rats were divided randomly into TBI group (n=96), CTP treating group (n=96) and fake operation group (n=96) and each of these three groups was divided into 8 subgroups, namely, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 168 and 336 hours. At the same time, the rest 12 rats were taked as the normal group for comparison. 3. Medication: The CTP treating group after injury were treated with CTP (30mg/kg/d) in peritoneum; TBI group, the fake operation group and the normal group were treated with Saline for comparison at the same time and all were killed at each time point. 4. Another 48 rats were divided randomly into 4 groups, namely, brain injury group, CTP treating group, fake operation group and the normal group, and their cognitive dysfuction was evaluated using the Morris water maze(MWM)5. Adopt such methods as H&E, immunohistochemistry, TUNEL stain and Morris water maze dynamically observe pathological changes in hippocampus of rats and the expressions of p53, Bax and Fas proteins and space learning and memorizing changes after brain injury. 6. Through comparing neuronal apoptosis in hippocampus of each group at the same time point after injury, the expressions of p53, Bax and Fas proteins and the change characteristics of learning and memorizing functions, the influences of CTP on learning and memorizing obstructions of rats after injury are probed into.
　　　Results: 1. At 72 hours postinjury, the comprehensive neuronal degeneration and necrosis could be observed  in the CA2-3 region of hippocampus. ,which tend to slow down as time went on.
　　　2. Apoptosis-positive cells began to occur at 24 hours postinjury and its number increased with the time went on and in 7days postinjury the number came to the maximum and then it began to decline. Apoptosis-positive cells lied mainly in the CA2-3 region and dentate gyrus of hippocampus. In the CA2-3 region of  hippocampus, apoptosis-positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and the normal group .
　　　3. P53 protein expression appeared in the CA2-3  region of hippocampus in rats at 3 hours postinjury, strengthened obviously 12 hours later, reached maximum after a day or two, and declined 3 days later. After 7 days, the immune reaction of p53 proteins could not be detected, and positive cells were brown-yellow under microscope. In the CA2-3 region of hippocampus, positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and in the normal group.
　　　4. Immune reaction of Bax proteins strengthened in the region of CA2-3 in hippocampus in rats at 6 hours postinjury, reached maximum after 2 days or three, declined obviously 7 days later, and restored to the normal level on the 14th day. Slight immune reactions of Bax proteins could be observed in the Ca2-3 region of hippocampus of the normal group, while no obvious difference existed between the fake operation group at every time point and the normal group.
　　　5. Fas protein expression strengthened in the CA2-3 region of hippocampus in rats at 6 hours postinjury, which became obvious 12 hours later, reached maximum after two days or three, and declined obviously 7 days later. Immune reactions of Fas proteins disappeared on the 14th day. Fas protein expression could not be detected in the C2-3 region of hippocampus in the fake operation group at every time point and in the normal group.
　　　6. In comparison with TBI group, the apex of the expressions of P53, Bax and Fas proteins of neurons in hippocampus of CTP treating group declined obviously and apoptosis-positive cells also declined.
　　7. Morris water maze tests showed that obvious space learning and memorizing obstruction existed in rats after injury, delitescence prolonged obviously 9 to 10 days later. Search moving tracks shows that search strategy altered more ideally with time in the normal group and fake operation group than in TBI group.
　　　　Conclusions: 1. After severe closed brain injury in rats, the phenomena of delayed cell death existed in the neurons in hippocampus, where neuronal necrosis and  apoptosis happen simultaneously.
　　　　2. Delayed death of nerve cells in hippocampus is one of the main causes of permanent learning and memorizing dysfunction in rats after injury.
　　　　3. The rising expressions of p53, Bax, and Fas proteins may participate in the regulation of the course of apoptosis after TBI .
　　　　4. CTP may suppress apoptosis of nerve cells after TBI through suppressing the expressions of p53, Fas, and Bax proteins.
　　　　5. CTP plays a important role in curing learning and memorizing obstruction after injury through suppressing necrosis and apoptosis of nerve cells, stimulating cell rehabilitation, and remolding information circulation route.
　　　
　　　Key Words: rats; severe closed traumatic brain injury; hippocampus; neuron; apoptosis; p53; Bax; Fas; cognitive; Morris water Maze; CTP

大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

前  言

　　　顱腦創(chuàng)傷及其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一。其中顱腦創(chuàng)傷后學(xué)習(xí)記憶障礙對(duì)人類的影響*為普遍和持久[1][2]。學(xué)習(xí)記憶是人類賴以生存所不可缺少的重要的腦功能之一，皮質(zhì)是調(diào)整學(xué)習(xí)過(guò)程的重要部位，海馬是記憶儲(chǔ)存的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[3]。近年來(lái)，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海馬作為腦損傷后選擇易損區(qū)，傷后出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡，從而出現(xiàn)長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)這一領(lǐng)域的研究大多局限于缺血性腦損傷，而有關(guān)腦創(chuàng)傷后這一領(lǐng)域的確切機(jī)制尚無(wú)**的報(bào)導(dǎo)。因此，本研究利用Marmarou重型閉合性顱腦損傷模型，采用**組織化學(xué)、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)及國(guó)際上先進(jìn)的Morris水迷宮技術(shù)對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及學(xué)習(xí)記憶功能障礙的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，同時(shí)應(yīng)用美洛寧進(jìn)行**，以期為臨床**顱腦創(chuàng)傷病人提供新的理論基礎(chǔ)和**途徑。
　　　
材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料
主要試劑：
 原位凋亡（TUNEL）試劑盒：由德國(guó)寶靈曼公司提供。
 P53、Bax、Fas**組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒：由北京市中山生物技術(shù)有限公司提供。
 美洛寧（購(gòu)自于廣東江門生物技術(shù)公司，**批號(hào)：粵衛(wèi)藥準(zhǔn)字第616021號(hào)）
主要儀器設(shè)備：
TGL-16B高速離心機(jī)（上海）。
 404-3型隔水式電熱培養(yǎng)箱（江蘇）。
 CMIAS-真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（北京）。
 OLYMPUS攝像顯微鏡（日本）。
 Leica石蠟切片機(jī)（德國(guó)）。
 MM-2型微量震蕩儀（江蘇）。
 上海欣軟信息科技有限公司研發(fā)的Xmaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)可用于開(kāi)展水迷宮實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
健康雄性Wistar大鼠（購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）348只，體重300g-350g。
實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
 取300只大鼠隨機(jī)分成腦創(chuàng)傷組（96只）、假手術(shù)組（96只）及美洛寧**組（96只）。每組又分別劃分為傷后3、6、12、24、48、72、168、336小時(shí)等8個(gè)時(shí)相組，其中腦創(chuàng)傷組、美洛寧**組、假手術(shù)組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組各12只大鼠。
 另取48只大鼠隨機(jī)分為腦創(chuàng)傷組、美洛寧**組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組，每組各12只。大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究
大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型制備
 大鼠于致傷前0.5小時(shí)，經(jīng)腹腔注射阿托品（30mg/kg/天）。
 以乙醚吸入方式麻醉動(dòng)物至疼痛刺激反應(yīng)消失。
 將麻醉后大鼠腹臥位固定于海綿床墊（10×10×20cm3）上，以75%酒精**術(shù)區(qū)后，沿中線矢狀切開(kāi)頭皮約15mm，剝離骨膜，顯露冠狀縫及人字縫，將一不銹鋼墊（直徑8mm，厚2mm）固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間。
 經(jīng)上述準(zhǔn)備后，大鼠頭部固定于致傷架下；重450g，直徑18mm的銅棒沿垂直玻璃管2m高度自由落下致傷；即刻移開(kāi)大鼠以免銅棒反彈造成頭部二次擊傷。
 致傷后，大鼠頭皮傷口常規(guī)**、縫合。
 假手術(shù)組僅給予麻醉及頭皮切開(kāi)、縫合，但不致傷。正常對(duì)照組不做任何處理。
動(dòng)物給**法
 美洛寧**組大鼠傷后經(jīng)腹腔注射美洛寧 1ml/次/只，每24小時(shí)1次直至各時(shí)相點(diǎn)處死。
 腦創(chuàng)傷組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組在相同時(shí)間內(nèi)給予等量生理鹽水腹腔注射。
標(biāo)本采集與制備
 于上述傷后各時(shí)相點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行乙醚吸入深度麻醉。
 開(kāi)胸，4%多聚甲醛經(jīng)心灌流固定10分鐘后，斷頭取出腦組織，置于4%多聚甲醛后固定12-24小時(shí)（4℃）。
 取出固定液中腦組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋。
 冠狀面連續(xù)切片，厚度約10μm，經(jīng)粘片劑處理過(guò)的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤1小時(shí)后，按下述方法進(jìn)行染色。
HE染色方法
2.5.1 選取腦組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯及100%、95%、80%、70%濃度酒精梯度脫蠟至水，用蒸餾水沖去殘存酒精成分。
2.5.2 明礬蘇木素染色8分鐘，自來(lái)水漂洗，去浮色（10秒鐘左右），以1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，自來(lái)水漂洗半小時(shí)。
 經(jīng)1%氨水溶液數(shù)秒后，自來(lái)水漂洗1次（10秒鐘左右）。
 0.5%伊紅溶液進(jìn)行復(fù)染3分鐘，經(jīng)漂洗去除伊紅浮色。
 經(jīng)70%、80%、95%酒精梯度脫水后，轉(zhuǎn)入無(wú)水酒精脫水6分鐘，二甲苯透明5分鐘，中性樹(shù)膠封片。
原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）法
 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
 切片滴加0.1%TritonX-100于4℃孵育5分鐘,PBS緩沖液洗5分鐘×3次。
 每張切片滴加TUNEL標(biāo)記反應(yīng)混合液50μL。置于濕盒中，37℃孵育1小時(shí)。
 PBS緩沖液洗5分鐘×3次。擦干組織切片后，每張切片滴加AP-轉(zhuǎn)化液50μL，置于濕盒中，37℃孵育30分鐘。
 PBS緩沖液洗5分鐘×3次。
 每張切片滴加BCIP/NBT顯色液20μL，室溫避光顯10-30分鐘，光鏡下觀察。
 鏡下顯色滿意后，PBS緩沖液洗2-3次終止顯色反應(yīng)。
 經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。
 鏡下觀察，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的染色質(zhì)為新月型或蠶豆?fàn)顫馊尽?br />p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白**組化檢測(cè)方法
 石蠟切片，常規(guī)脫臘至水。
 3%過(guò)氧化氫溶液室溫下孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。
 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
 抗原修復(fù)15分鐘（溫度為92-98℃，修復(fù)液為檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液，PH為6.0）。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加封閉用正常血清工作液50μL，室溫孵育10-15分鐘，傾去，勿洗。
 滴加一抗（稀釋度：p53為1:50，Bax及Fas均為1:100）工作液50μL/張，37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加生物素化二抗工作液50μL/張，37℃孵育5-10分鐘。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液50μL/張，37℃孵育15-20分鐘。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 DAB顯色劑顯色15-20分鐘。
 鏡下顯色滿意后，自來(lái)水充分沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。
圖象分析
采用CMIAS-真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（由北京航空航天大學(xué)提供）和OLYMPUS攝像顯微鏡進(jìn)行海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)（個(gè)/400倍視野）及陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（OD）的測(cè)定。
　2.11 Morris水迷宮測(cè)試
2.11.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)內(nèi)外研究中廣泛應(yīng)用的檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶功能***、客觀的一種方法。正常對(duì)照組、假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組大鼠分別于傷后7、8、9、10天進(jìn)行水迷宮測(cè)試。
 實(shí)驗(yàn)時(shí)，將**島隨機(jī)置于水迷宮四個(gè)象限（N、S、E、W）中的任一象限，加水（奶粉沖呈乳白色）至高過(guò)**島10mm，水溫保持在22℃-25℃，由攝象機(jī)及計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤、拍攝和統(tǒng)計(jì)大鼠分別由其他三個(gè)象限入水后尋找到**島的軌跡和潛伏值。如在180秒內(nèi)未找到**島，則潛伏期值記為180秒。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　　實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均用X±S表示，經(jīng)access數(shù)據(jù)庫(kù)整理后應(yīng)用美國(guó)SAS統(tǒng)計(jì)軟件6.12 TS 020 for windows，進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。以單側(cè)P≤0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義，P≤0.01為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著性意義。大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)  果

1 閉合型顱腦創(chuàng)傷模型的復(fù)制
　　按照Marmarou方法建立模型[4]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠致傷后多數(shù)出現(xiàn)有短暫呼吸停止，給予人工輔助呼吸后，自主呼吸多于30-40秒內(nèi)恢復(fù)（自主呼吸未恢復(fù)者，死亡）；傷后大鼠多表現(xiàn)有四肢劇烈抽搐，持續(xù)時(shí)間約15-30秒，隨后前肢呈去皮層屈曲狀態(tài)；大鼠傷后均呈昏迷狀態(tài)，多于10-20分鐘內(nèi)意識(shí)狀態(tài)恢復(fù)并復(fù)正。上述觀察結(jié)果與Marmarou所描述的模型傷后表現(xiàn)大致相符，說(shuō)明我們復(fù)制的模型是成功的。
傷后海馬區(qū)HE染色組織病理結(jié)果：
　　傷后24小時(shí)，腦創(chuàng)傷組大鼠海馬區(qū)及齒狀回即出現(xiàn)散在變性壞死神經(jīng)元，鏡下可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮，色粉紅，核皺縮濃染，細(xì)胞周圍出現(xiàn)空隙；傷后72小時(shí)，海馬CA2-3區(qū)可觀察到廣泛水腫及神經(jīng)元變性壞死改變，視野內(nèi)可見(jiàn)有核溶解及神經(jīng)元細(xì)胞空泡樣變，神經(jīng)元存活數(shù)目明顯減少，細(xì)胞間隙顯著增寬；傷后7及第14天，海馬CA1-4區(qū)上述病理趨勢(shì)有所緩解。美洛寧**組于傷后72小時(shí)海馬CA2-3區(qū)組織病理改變較創(chuàng)傷組有明顯改善（見(jiàn)Fig.1-2）。
傷后皮層和海馬區(qū)P53、Bax、Fas蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：
大鼠傷后3小時(shí)海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)P53蛋白表達(dá)。12小時(shí)明顯增強(qiáng)，1-2天達(dá)高峰，3天即有所下降，于傷后7天已不能檢測(cè)到p53蛋白的**反應(yīng)，鏡下觀察可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞著棕黃色。于傷后1-2天美洛寧**組較創(chuàng)傷組p53蛋白的**反應(yīng)明顯減輕（見(jiàn)Table 1、Fig.3-9）。假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組海馬CA2-3區(qū)未檢測(cè)出表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。
Table 1：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞p53蛋白表達(dá)改變（OD值）
分 組 時(shí)      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.058±0.013 0.107±0.014 0.149±0.016 0.115±0.017 0.053±0.012 12
**組 0.052±0.011 0.083±0.016* 0.106±0.017** 0.085±0.018* 0.039±0.011* 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01

大鼠傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應(yīng)增強(qiáng)，2-3天達(dá)高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復(fù)至正常水平。于傷后2-3天美洛寧**組較創(chuàng)傷組的Bax蛋白的**反應(yīng)明顯減輕（見(jiàn)Table 2、Fig.10-17）。正常對(duì)照組CA2-3區(qū)可見(jiàn)輕度的Bax蛋白**反應(yīng)，假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)均與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究
Table 2：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)改變（OD值）
分 組 時(shí)      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.067±0.009 0.082±0.011 0.101±0.018 0.140±0.015 0.147±0.019 12
**組 0.052±0.008 0.068±0.012* 0.078±0.017* 0.111±0.018* 0.104±0.015** 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01  正常組的OD值為0.038±0.008
3.3  大鼠傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達(dá)增加，12小時(shí)明顯增強(qiáng)，2-3天達(dá)高峰，7天明顯下降，于傷后14天Fas蛋白**反應(yīng)消失。傷后2-3天美洛寧**組較創(chuàng)傷組Fas蛋白的**反應(yīng)明顯減輕見(jiàn)(Table 3、Fig.18-24)。假手術(shù)組各時(shí)相點(diǎn)及正常對(duì)照組海馬CA2-3區(qū)未檢測(cè)到Fas蛋白的表達(dá)。
Table 3：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)改變（OD值）
分 組 時(shí)      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.127±0.015 0.171±0.025 0.232±0.028 0.255±0.023 0.247±0.025 12
**組 0.123±0.016 0.157±0.020 0.189±0.025* 0.179±0.025** 0.174±0.021** 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01 
  傷后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：
　　　正常對(duì)照組及假手術(shù)組海馬未見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。腦創(chuàng)傷組大鼠傷后24小時(shí)，海馬CA2-3區(qū)即出現(xiàn)少量凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，鏡下陽(yáng)性細(xì)胞核著藍(lán)紫色；傷后72小時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多；于傷后7天達(dá)高峰；傷后14天凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有所下降。與美洛寧**組同時(shí)相點(diǎn)比較，傷后7天及14天差異性顯著（見(jiàn)Table 4、Fig.25-31 ）。
Table 4：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細(xì)凋亡改變動(dòng)態(tài)觀察
分 組 時(shí)      相 n
 24h 48h 72h 168h 336h 
創(chuàng)傷組 18.00±3.408 21.18±3.750 24.45±3.067 29.18±4.67 15.26±3.350 12
**組 17.45±3.504 19.45±3.11 21.19±3.562* 21.00±4.64** 11.82±2.560* 12
單位：個(gè)/400倍視野    * P﹤0.05  ** P﹤0.01 
　  Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果：
　　　為避免大鼠顱腦創(chuàng)傷后運(yùn)動(dòng)功能障礙對(duì)水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響，各組分別于傷后7、8、9及第10天進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。結(jié)果表明，創(chuàng)傷組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**島潛伏期較正常組及假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)。美洛寧**組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**島潛伏期較創(chuàng)傷組明顯縮短（見(jiàn)Table 5、Fig.32-35）。
Table 5：腦創(chuàng)傷后各組Morris水迷宮測(cè)試潛伏期（單位：秒）
分 組 時(shí)    相 n
 7天 8天 9天 10天 
正常組 140.25±22.54 96.50±18.92 42.66±11.15 28.83±8.92 12
假手術(shù)組 144.25±16.13 96.91±22.05 41.15±12.23 28.67±9.45 12
創(chuàng)傷組 168.08±25.16* 128.5±27.17* 79.08±19.51** 57.06±19.08** 12
**組 150.58±21.46+ 99.41±21.04+ 50.83±15.69++ 30.25±9.28++ 12
* P<0.05vs正常組  ** P<0.01vs正常組
+ P<0.05vs創(chuàng)傷組  ++ P<0.01vs創(chuàng)傷組

討  論   大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

學(xué)習(xí)和記憶障礙是各種顱腦損傷病人傷后*為常見(jiàn)的腦功能障礙之一，病人主要表現(xiàn)為傷后短期的學(xué)習(xí)能力下降，長(zhǎng)期的語(yǔ)言、視覺(jué)、辨認(rèn)記憶功能障礙和記憶存儲(chǔ)障礙[5]。目前，臨床對(duì)該癥尚缺乏有效的**手段。近年來(lái)，海馬作為學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)及腦損傷后的選擇性易損區(qū)得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)：（1）海馬區(qū)是學(xué)習(xí)記憶形成環(huán)路中重要的功能解剖結(jié)構(gòu)；（2）海馬信息通路主要由齒狀回、完整的海馬CA1-3區(qū)、大腦腳聯(lián)合及內(nèi)嗅區(qū)皮層組成；（3）信息通路中的信號(hào)由內(nèi)嗅區(qū)皮層向齒狀回門區(qū)、海馬CA3、CA1區(qū)及大腦腳聯(lián)合單向傳導(dǎo)，*后再由大腦腳聯(lián)合投射至內(nèi)嗅區(qū)皮層的特定部位完成整個(gè)環(huán)路[6]。以往在這方面的實(shí)驗(yàn)研究多限于缺血性腦損傷模型，而有關(guān)其在顱腦創(chuàng)傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙中所起的作用尚無(wú)詳盡的報(bào)導(dǎo)。近年來(lái)，人們成功的創(chuàng)立了多種類型的顱腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型，從而為廣泛開(kāi)展這一領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，閉合性顱腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型可成功復(fù)制出與人類腦創(chuàng)傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙相一致的臨床特征，并具有簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定性及重復(fù)性好等特點(diǎn)[7][8]。因此，本研究采用Marmarou等人創(chuàng)立的重型顱腦創(chuàng)傷模型，從分子生物學(xué)角度初步探討了創(chuàng)傷條件下海馬區(qū)病理改變的有關(guān)機(jī)制及其對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響。
一、顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與學(xué)習(xí)記憶功能障礙
細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下通過(guò)啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制，主要是通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的自然死亡過(guò)程。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及可塑性發(fā)揮重要作用，而且還與成熟神經(jīng)系統(tǒng)的病理狀態(tài)，如：腦缺血及低血糖等密切相關(guān)。Grant Sinson等[9]在液壓腦創(chuàng)傷模型中研究發(fā)現(xiàn)：腦創(chuàng)傷后24小時(shí)，皮層、海馬及隔區(qū)即可出現(xiàn)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。本研究應(yīng)用TUNEL法對(duì)大鼠重型閉合性顱腦損傷模型進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果顯示，傷后海馬區(qū)存在著神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞于傷后24小時(shí)出現(xiàn)，7天達(dá)高峰，傷后14天明顯下降。同時(shí)，HE染色發(fā)現(xiàn)傷后72小時(shí)存在著廣泛的神經(jīng)元的變性壞死。這表明腦創(chuàng)傷后存在著神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡，不僅表現(xiàn)為壞死，也表現(xiàn)為凋亡。
Bonfoco 等[10]在體外皮層神經(jīng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，加入低濃度外源性NMDA可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)病理改變，而高濃度則導(dǎo)致細(xì)胞壞死的發(fā)生，提示興奮性氨基酸毒性與細(xì)胞的壞死、凋亡密切相關(guān)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡的過(guò)程，我們認(rèn)為：（1）腦創(chuàng)傷后早期興奮性氨基酸的過(guò)度釋放，依其不同濃度及持續(xù)時(shí)間，同時(shí)誘導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，以細(xì)胞壞死為主要病理表現(xiàn)；（2）腦創(chuàng)傷后期，隨興奮性氨基酸濃度的下降，神經(jīng)細(xì)胞的延遲性死亡則以凋亡為主，但仍同時(shí)伴有細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)病理改變，這可能與腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)因素，如：細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載有關(guān)。Fineman等[11]報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度于腦創(chuàng)傷后48小時(shí)達(dá)高峰值，這一結(jié)果也從側(cè)面肯定了我們的推測(cè)。
腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞主要存在三種死亡形式：物理?yè)p傷性死亡、興奮性毒性死亡及延遲性細(xì)胞死亡。其中，延遲性細(xì)胞死亡是導(dǎo)致長(zhǎng)期腦功能障礙的主要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，顱腦創(chuàng)傷后，大鼠海馬CA2-3區(qū)存在有神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，持續(xù)時(shí)間至傷后14天：同時(shí)，我們于傷后7-10天利用世界上先進(jìn)的水迷宮技術(shù)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)傷后9及10天出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。據(jù)此，我們認(rèn)為：腦創(chuàng)傷后作為學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)構(gòu)的海馬區(qū)域存在著神經(jīng)細(xì)胞延遲性丟失，影響了細(xì)胞間的信息單向傳遞及整合，導(dǎo)致了大鼠長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)記憶障礙。
二、海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞p53蛋白表達(dá)與凋亡
　　　P53基因是一種重要的抑癌基因，正常的p53基因即野生型p53基因（wt-p53）與突變型p53基因（m-p53），均參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，野生型p53對(duì)凋亡有促進(jìn)作用，而突變型p53對(duì)凋亡有抑制作用。腦損傷可導(dǎo)致野生型p53蛋白的表達(dá)增加[12]，而突變型p53蛋白迄今為止，只在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[13]。由于我們檢測(cè)到的p53蛋白主要位于損傷后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的位置，因此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的p53蛋白為野生型p53蛋白。
　　　目前，分子生物學(xué)研究結(jié)果已初步了解p53介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程 [14]。推測(cè)p53介導(dǎo)受損神經(jīng)細(xì)胞凋亡的幾個(gè)環(huán)節(jié)如下：⑴首先某種損傷因素（很可能是DNA的輕微損傷）誘導(dǎo)p53在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平大量表達(dá)。⑵核內(nèi)p53 蛋白大量堆積，并與損傷DNA（通常為單鏈）結(jié)合，使p53由靜止?fàn)顟B(tài)激活，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，如：p21WAF表達(dá)產(chǎn)物可使細(xì)胞周期靜止于G1點(diǎn)，并影響細(xì)胞周期蛋白活性，使細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖受到抑制[15]，但這一點(diǎn)可能對(duì)神經(jīng)元作用不大。⑶p53 蛋白表達(dá)后選擇性地抑制c-myc基因的轉(zhuǎn)錄，使c-myc mRNA迅速下降，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。⑷p53還可以增加bax、IGF、Fas等表達(dá)，而間接降低抑凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。⑸p53也可能直接下調(diào)bcl-2的表達(dá)，從而增加神經(jīng)元凋亡的易感性[16]。⑹p53 蛋白還可以通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)其它蛋白形成復(fù)合物，如復(fù)制蛋白抗原（RPA）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物IIH（TFIIH）、修復(fù)因子（GADD-45）等，以參與DNA合成、復(fù)制、修復(fù)及損傷 [17]。
　　　Kaya等[12]利用CCI模型研究了wt-p53蛋白，p53反應(yīng)蛋白及細(xì)胞循環(huán)蛋白（Cyclin D1）的表達(dá)，認(rèn)為DNA的損傷誘導(dǎo)了wt-p53蛋白，該蛋白激活了一系列下位效應(yīng)基因，這些效應(yīng)基因產(chǎn)物參與了細(xì)胞循環(huán)停止、DNA修復(fù)及凋亡。Napieralski等[19]用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)研究了大鼠一側(cè)液壓腦損傷后腫瘤抑制基因p53、細(xì)胞循環(huán)基因cyclin D1的mRNA表達(dá)的區(qū)域分布及時(shí)程。在假手術(shù)組的腦組織沒(méi)有或僅有極少量的p53mRNA的表達(dá)。在傷后6小時(shí)，p53mRNA主要被誘導(dǎo)于TBI易損區(qū)的細(xì)胞，如挫傷的皮質(zhì)、丘腦的膝狀核的中部和側(cè)部的細(xì)胞以及海馬CA3區(qū)及門部的神經(jīng)元。p53mRNA的增長(zhǎng)也在海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元，即那些對(duì)液壓腦損傷相對(duì)耐受的細(xì)胞中檢測(cè)到。認(rèn)為p53參與了TBI后的分子反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)重型閉合性顱腦創(chuàng)傷傷后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)及凋亡情況進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傷后3小時(shí)海馬CA2-3區(qū)錐體細(xì)胞層即可檢測(cè)到p53蛋白的**反應(yīng)，于12小時(shí)**反應(yīng)明顯增強(qiáng)，此時(shí)p53蛋白主要定位于胞漿，于傷后1-2天p53蛋白表達(dá)達(dá)高峰，此時(shí)于胞核中亦出現(xiàn)明顯的P53蛋白的**反應(yīng)，傷后3天開(kāi)始下降。P53蛋白先于凋亡的高峰出現(xiàn)，且與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分布大致相符。以上結(jié)果表明，顱腦創(chuàng)傷能夠誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá)，p53蛋白可能參與了調(diào)控傷后神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡的病生理過(guò)程。
三、海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)與凋亡
　　　Bax是Bcl-2家族中*具有促死亡特征的基因。Bax被表達(dá)并轉(zhuǎn)位于線粒體是對(duì)各種細(xì)胞死亡信號(hào)的反應(yīng)[20]。促凋亡的Bcl-2家族成員能夠?qū)е录?xì)胞色素C從線粒體中釋放到胞漿[21]，接著細(xì)胞色素C和apaf-1，即CED-4的等同物以及dATP相互作用[22]，這個(gè)被激活的復(fù)合物可以產(chǎn)生具有活性的caspase-9，caspase-9可以斷裂其他的caspase（包括pro-caspase-3），使之具有活性[23]，caspase-3和其它的caspases協(xié)調(diào)一致，通過(guò)對(duì)各種蛋白進(jìn)行分解從而促使細(xì)胞死亡[24]。
　　　本研究顯示：大鼠傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應(yīng)增強(qiáng)，**反應(yīng)主要定位于胞漿，胞核也可見(jiàn)到，呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。于2-3天達(dá)高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復(fù)至正常水平。這和國(guó)內(nèi)的有些學(xué)者在液壓腦損傷模型中的研究基本相似[25]，只是時(shí)程較長(zhǎng)，這可能與致傷方法和致傷程度不同。
　　　O'Dell等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮質(zhì)創(chuàng)傷性腦損傷后24小時(shí)bax mRNA表達(dá)增加。Lu等[27]在對(duì)大鼠閉合性腦損傷后**神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡的時(shí)程進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在傷后4小時(shí)Bax蛋白表達(dá)增高，并伴隨著B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)，在傷后1天處死的大鼠發(fā)現(xiàn)不同數(shù)量的TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞。認(rèn)為Bcl-2和Bax的比例改變參與了閉合性腦損傷后**神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡。有人研究發(fā)現(xiàn)液壓腦損傷后早期Bcl-2和Bcl-x蛋白水平下降，損傷的后期Bax蛋白水平升高[25]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們認(rèn)為：（1）顱腦創(chuàng)傷誘導(dǎo)了Bax蛋白表達(dá)增加，改變了線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，激活了caspases，促使細(xì)胞死亡。（2）Bax蛋白增加改變了與能夠抑制凋亡的Bcl-2及Bcl-x的比例，抑制了Bcl-2及Bcl-x蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，間接的促進(jìn)了細(xì)胞的死亡。
四、海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)與凋亡
　　　Fas蛋白屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NGFR）/腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員，這一家族成員對(duì)細(xì)胞生存、分化及**反應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮著廣泛的作用[28]。Fas蛋白在功能上與TNF-RI密切相關(guān)，因?yàn)閮烧叨紦碛幸粋€(gè)能夠傳遞細(xì)胞毒性/凋亡信號(hào)的死亡結(jié)構(gòu)域[28]。FasL與Fas結(jié)合可促發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)事件，*終導(dǎo)致靶細(xì)胞的caspases激活，細(xì)胞死亡[29]。此外，F(xiàn)asL和Fas結(jié)合可導(dǎo)致死亡結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞漿適配蛋白FADD發(fā)生聯(lián)系，這接下來(lái)恢復(fù)了caspase-8的活性，促發(fā)一連串的凋亡事件。現(xiàn)已經(jīng)在多種細(xì)胞類型中檢測(cè)到Fas抗原，包括B、T**細(xì)胞系、腸、胸腺、肝、卵巢及心臟，fas-fasL系統(tǒng)在保持**特權(quán)中發(fā)揮重要作用[30]。FasL在眼和睪丸中持續(xù)表達(dá)，有人報(bào)道在人、小鼠及大鼠的星形細(xì)胞中也有表達(dá)[31]。
　　　本實(shí)驗(yàn)中，大鼠閉合性顱腦損傷傷后6小時(shí)海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達(dá)增加，于12小時(shí)明顯增強(qiáng)，2-3天達(dá)高峰，7天明顯下降，于14天Fas蛋白**反應(yīng)消失。我們發(fā)現(xiàn)Fas蛋白的**反應(yīng)不但定位于胞漿，而且在核區(qū)出現(xiàn)更加強(qiáng)烈的染色，腦損傷后Fas蛋白在胞核中強(qiáng)烈表達(dá)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
　　　有關(guān)腦損傷后Fas蛋白的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外鮮有人報(bào)道。Rosenbaum等[32]證實(shí)，大鼠局灶性腦缺血后缺血區(qū)的神經(jīng)元fas及fasl表達(dá)增加，說(shuō)明fas介導(dǎo)的凋亡參與了腦缺血的病理生理學(xué)過(guò)程。Beer等[33]在研究大鼠實(shí)驗(yàn)性TBI后Fas及Fasl的表達(dá)時(shí)程中發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷后15分鐘至72小時(shí)損傷部位同側(cè)皮質(zhì)內(nèi)分別見(jiàn)到增強(qiáng)的Fas及Fasl的**反應(yīng)。結(jié)合本研究結(jié)果，F(xiàn)as蛋白的**反應(yīng)高峰先于凋亡的高峰出現(xiàn)，我們認(rèn)為：Fas及Fasl參與了大鼠閉合性顱腦損傷后凋亡性神經(jīng)變性的病理學(xué)機(jī)制。
五、美洛寧對(duì)腦損傷后學(xué)習(xí)記憶障礙的影響
　　　美洛寧（三磷酸胞苷二鈉）為一種促神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和再生的**，具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和血腦屏障，以及減輕毒性代謝物質(zhì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害作用。本實(shí)驗(yàn)中，美洛寧**組于傷后9天（P﹤0.01）及第10天（P﹤0.01），Morris水迷宮測(cè)試潛伏期明顯低于創(chuàng)傷組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而于正常組相比無(wú)明顯差異。運(yùn)動(dòng)軌跡圖象分析顯示，正常對(duì)照組、假手術(shù)組及美洛寧**組大鼠傷后隨時(shí)間在搜索策略的改變上也較創(chuàng)傷組更為理想。同時(shí)，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，美洛寧能夠明顯抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡基因p53、Bax和Fas蛋白的表達(dá)，并且使該區(qū)凋亡細(xì)胞的高峰下調(diào)。
　　　三磷酸胞苷（CTP）作為參與磷脂、蛋白質(zhì)及核酸代謝的有效成分，能夠**營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。國(guó)外有實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)了CTP能減輕甚至逆轉(zhuǎn)多種原因所引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，如：中毒性、代謝性、創(chuàng)傷性及缺血性腦損傷等[34]。重型顱腦損傷可導(dǎo)致不同程度的顱內(nèi)壓增高、腦灌注壓降低、腦缺血、缺氧等。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CTP**外傷引起的意識(shí)障礙等神經(jīng)功能紊亂，主要是通過(guò)其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用來(lái)降低腦水腫。磷脂酰乙醇胺（腦磷脂）和磷脂酰膽堿（卵磷脂）是細(xì)胞膜的主要成分，CTP直接參與甘油磷脂與核酸的合成。研究表明，細(xì)胞內(nèi)磷酸乙醇胺胞苷?；D(zhuǎn)移酶（PECT）、磷酸膽堿胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶（PCCT）的活性和磷酸酯合成率對(duì)CTP細(xì)胞濃度具有高度的依賴性。PECT對(duì)CTP的依賴性更大[35]。CTP通過(guò)多種途徑參與腦磷脂合成，在提高神經(jīng)細(xì)胞膜的合成率方面發(fā)揮重要作用[36]。
　　　綜上所述，我們認(rèn)為美洛寧能夠有效的改善大鼠腦創(chuàng)傷后空間學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能為：1、為傷后神經(jīng)細(xì)胞提供能量，減少由于缺血、缺氧而產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害；2、抑制了傷后凋亡相關(guān)基因，如p53、Bax及Fas蛋白的表達(dá)，減少傷后神經(jīng)細(xì)胞的延遲性死亡；3、為傷后神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，參與甘油磷脂及核酸的合成，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生，重建海馬信息環(huán)路。
　　　總之，顱腦創(chuàng)傷后存在學(xué)習(xí)記憶功能障礙，傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是多種因素改變相互作用的結(jié)果。本研究中，我們討論了腦創(chuàng)傷后p53、Bax及Fas蛋白的表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡與學(xué)習(xí)記憶功能障礙之間的聯(lián)系，以及美洛寧對(duì)其的影響，而它們與其它因素之間的內(nèi)在聯(lián)系，尚需我們?cè)诜肿由飳W(xué)水平進(jìn)一步探討，這將為臨床**顱腦損傷，特別是基因**的開(kāi)展提供新的思路。
　　　
結(jié)  論
　　　
　　　本研究應(yīng)用Marmarou閉合性顱腦創(chuàng)傷模型，采用HE染色、**組織化學(xué)、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)及Morris水迷宮技術(shù)對(duì)傷后大鼠海馬區(qū)p53蛋白、Bax蛋白和Fas蛋白的表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡以及與大鼠傷后空間學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系進(jìn)行了研究，探討了美洛寧對(duì)大鼠傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙的**作用，結(jié)論如下：
1 重型閉合性顱腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元存在延遲性細(xì)胞死亡現(xiàn)象，其形式不僅表現(xiàn)為壞死，也表現(xiàn)有細(xì)胞的凋亡。
海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡是造成傷后長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙的主要因素之一。
凋亡相關(guān)蛋白p53、Fas及Bax的表達(dá)改變可能參與調(diào)控了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。
美洛寧可能通過(guò)抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
美洛寧可能通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)及重塑信息環(huán)路對(duì)傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙發(fā)揮**作用。

大鼠腦創(chuàng)傷后對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究